完全性肺靜脈異位引流基因?qū)W研究進(jìn)展

王靜、石鑫、陳筍、孫錕綜述，于昱審校

完全性肺靜脈異位引流（total anomalous pulmonary venous connecting，TAPVC）是一種罕見的先天性心臟病（先心?。?，指全部肺靜脈未與左心房相連，而與體循環(huán)靜脈或右心房相連。其發(fā)生率約0.6～1.2/10 000 例新生兒，約占先心病發(fā)病率的0.7～1.5%[1]。Neill 等1960 年首次在彎刀綜合征中描述了 TAPVC。發(fā)病的患兒多以青紫、心臟雜音等臨床表現(xiàn)首次就診，常伴呼吸道感染、喂養(yǎng)困難、充血性心力衰竭等臨床癥狀[2]。盡管彩色超聲多普勒檢查可以確診，其仍然是產(chǎn)前診斷中容易漏診的心臟病[3]。TAPVC 患者在嬰幼兒甚至新生兒期出現(xiàn)嚴(yán)重的癥狀，需要早期手術(shù)治療，手術(shù)以恢復(fù)肺靜脈與心房連接的解剖位置為主[4]?；純? 歲前如果沒有手術(shù)干預(yù)，死亡率達(dá)到48.8%[5]。因此，TAPVC嚴(yán)重危害嬰幼兒健康，給家庭和社會(huì)造成了沉重的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。以下將分別從肺靜脈胚胎發(fā)育角度和基因角度對(duì)TAPVC 的病因進(jìn)行闡述，為TAPVC 的預(yù)防、治療提供理論指導(dǎo)。

1 肺靜脈胚胎發(fā)育中TAPVC 的形成過(guò)程

肺靜脈的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，發(fā)生在胚胎早期，通過(guò)對(duì)人和動(dòng)物的胚胎學(xué)研究，一個(gè)廣為接受的學(xué)說(shuō)認(rèn)為：肺芽起自前腸，匯入內(nèi)臟靜脈叢。血循環(huán)開始于肺芽，妊娠34 天即有血液循環(huán)通過(guò)肺芽，收集成對(duì)的主靜脈血和臍卵黃靜脈血后終止于內(nèi)臟靜脈叢。右側(cè)的主靜脈系統(tǒng)最終發(fā)育為右上腔靜脈（superior vena cava，SVC），而左側(cè)的主靜脈系統(tǒng)大多退化，僅有不到1%的人存在左上腔靜脈；臍卵黃靜脈發(fā)育為下腔靜脈（inferior vena cava，IVC）、門靜脈系統(tǒng)和靜脈導(dǎo)管。

隨著肺的發(fā)育，肺靜脈回流通過(guò)內(nèi)臟靜脈叢與卵黃-臍靜脈的連接，將血從肺引流出與共同肺靜脈（common pulmonary vein，CPV）相通，共同肺靜脈匯入左心房的背側(cè)，最終發(fā)育成4 條分開的肺靜脈。肺靜脈發(fā)育的最后階段是肺芽與內(nèi)臟靜脈叢連接的閉鎖。如果共同的肺靜脈與左心房連接完全閉鎖，那么4 條肺靜脈全部與體循環(huán)連接，即形成完全型肺靜脈異位連接；如果僅部分肺靜脈與左心房連接閉鎖，而與體循環(huán)連接，則形成部分型肺靜脈異位連接。但是，TAPVC 形成的具體生理過(guò)程目前尚不明確，除了胚胎時(shí)期肺靜脈發(fā)育異常外，從遺傳學(xué)角度出發(fā)，基因是否在TAPVC 發(fā)病中扮演一定的角色呢？

2 TAPVC 形成的基因研究

人類TAPVC 家系遺傳學(xué)研究表明，TAPVC 為常染色體顯性遺傳，具有不完全外顯率及可變表達(dá)特性。近年來(lái)研究證實(shí)大量的候選基因與TAPVC 的發(fā)病關(guān)系密切。本綜述僅選取幾個(gè)基因作具體的概括總結(jié)，詳情見表1。

2.1 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（KDR）和血小板起源的生長(zhǎng)因子受體（PDGFRA）

Bleyl 等之前提出一種觀念：從基因?qū)W角度來(lái)說(shuō)，TAPVC 發(fā)病與某個(gè)區(qū)域堿基的缺失或者重復(fù)有關(guān)，該區(qū)域被稱為TAPVR-1 基因區(qū)間，該區(qū)間定位于4q12。TAPVR-1 區(qū)間大概有30 個(gè)基因，包括幾個(gè)已知與心血管發(fā)育相關(guān)的基因，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（kinase insert domain receptor，KDR or vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）。KDR，在血管生成、血管發(fā)育、血管通透性和胚胎造血功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、存活、遷移和分化。KDR 及其小鼠同源基因在體外以高親和力結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，并在內(nèi)皮細(xì)胞前體中表達(dá)。因而Bleyl 等[6]將KDR 作為TAPVC 發(fā)病的候選基因。之后Bleyl 等以雞胚胎和老鼠為模型驗(yàn)證了PDGFRA 在肺靜脈發(fā)育過(guò)程中表達(dá)異常導(dǎo)致的功能障礙會(huì)引起TAPVC 的發(fā)生[7]。Bleyl 等[6]用PDGFR 的阻滯劑伊馬替尼處理肺靜脈正處于發(fā)育階段的雞胚胎，發(fā)現(xiàn)79 只胚胎有32 只存活（32/79），存活的胚胎中有8 只出現(xiàn)TAPVC 的表型（8/32），即肺靜脈與冠狀靜脈竇相連，同時(shí)伴隨神經(jīng)管畸形、腦出血等畸形。然而用生理鹽水或生素處理作對(duì)照的雞胚胎并沒有TAPVC 表型的出現(xiàn)。在103 只PDGFRA 敲除的鼠胚胎（29 只全部敲除和74 只條件敲除），出現(xiàn)較高比率（＞30%）的流入道異常，包括TAPVC（＜7%）。然而在對(duì)照處理的胚胎中并沒有TAPVC 出現(xiàn)。通過(guò)對(duì)雞和老鼠切片做原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：PDGFRA 受體和它的配體在老鼠和雞胚胎表達(dá)部位和時(shí)段與人類肺靜脈發(fā)育是相一致。總而言之，從人群樣本與動(dòng)物模型收集到的數(shù)據(jù)支持此種觀點(diǎn)：PDGFRA 在正常肺靜脈發(fā)育中發(fā)揮重要的作用，是TAPVC 的易感基因。

表1 TAPVC 候選基因總結(jié)

2.2 錨鏈重復(fù)域1（ANKRD1）

ANKRD1 在內(nèi)皮細(xì)胞的激活發(fā)揮作用，是心臟特異性轉(zhuǎn)錄抑制物[8]。定位于10q23。Cinquetti 等[18]報(bào)道1 例10，21 染色體異位的TAPVC 患者，而10，21染色體異位影響基因ANKRD1 的正常表達(dá)。除此之外，也影響到位于10 號(hào)染色體另外兩個(gè)基因的表達(dá)，即RPP30 和PCGF5。小鼠胚胎原位雜交結(jié)果顯示ANKRD1 在發(fā)育階段中的肺靜脈中特異性表達(dá)，推測(cè)該基因在TAPVC 發(fā)病中可能發(fā)揮一定的作用。隨后，Cinquetti 發(fā)現(xiàn)了第二例TAPVC 患者的淋巴母細(xì)胞細(xì)胞中ANKRD1 高表達(dá)，進(jìn)一步推測(cè)ANKRD1表達(dá)量異?？赡芘cTAPVC 的發(fā)病相關(guān)。最后在第三例散發(fā)性TAPVC 患者身上發(fā)現(xiàn)了ANKRD1 基因中的錯(cuò)義突變（p.Thr116Met）。并且體外試驗(yàn)證明了該位點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)了ANKRD1/ CARP 蛋白的穩(wěn)定性及其抑制心臟特異性心房利鈉因子（ANF）啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。Cinquetti 認(rèn)為ANKRD1 過(guò)表達(dá)在心臟發(fā)育過(guò)程中干擾了靜脈-心房形態(tài)的形成，因而將ANKRD1定義為TAPVC 致病的候選基因。

2.3 軸突向?qū)б蜃?D（semaphorin 3D，SEMA3D）

SEMA3D，定位于7q21。Semaphorins 最初被確定為軸突導(dǎo)向分子[19]，但涉及多種生物學(xué)過(guò)程，包括心血管的形成。3 類軸突向?qū)б蜃?，主要通過(guò)神經(jīng)氈蛋白、神經(jīng)叢蛋白或兩者共同受體復(fù)合物發(fā)出信號(hào)的分泌分子。SEMA3D 編碼的蛋白質(zhì)與斑馬魚的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突和神經(jīng)嵴遷移有關(guān)。之前，根據(jù)動(dòng)物模型有人提出這樣一個(gè)觀點(diǎn)：TAPVC發(fā)生是因?yàn)榉戊o脈的前體，即中咽部?jī)?nèi)皮細(xì)胞沒有在胚胎心房的背部正確位置定位。但是Degenhardt等[9]研究發(fā)現(xiàn)，盡管中咽部?jī)?nèi)皮細(xì)胞在心房背部正確定位，有35%（14/36）SEMA3D 敲除鼠出現(xiàn)TAPVC 或者PAPVC 的表型，即右心房和右心室肥大，肺靜脈與冠狀靜脈竇相連或者與右心房直接相連，而出現(xiàn)異常的老鼠中大多數(shù)是TAPVC（13/14），且伴有房間隔缺損，沒有發(fā)現(xiàn)其他心內(nèi)畸形或者偏側(cè)器官缺陷。而且在這些突變鼠胚胎，肺靜脈叢和中咽部?jī)?nèi)皮細(xì)胞不能正確的吻合。對(duì)有肺靜脈連接異常的患者測(cè)序發(fā)現(xiàn)SEMA3D 有F602L 位點(diǎn)突變，干擾了SEMA3D 的正常功能。Degenhardt 認(rèn)為SEMA3D 是通過(guò)指引肺靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的定位來(lái)調(diào)節(jié)肺靜脈的發(fā)育，SEMA3D 對(duì)周圍細(xì)胞有排斥作用，而SEMA3D F602L 位點(diǎn)突變降低了這種排斥能力。Degenhardt 等[9]提出了這樣一種模型，正常情況下，SEMA3D 在心臟和肺血管之間部位表達(dá)，排斥內(nèi)皮細(xì)胞在此部位形成異常連接；而SEMA3D 缺乏時(shí)，排斥的作用消失，允許內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入此部位形成靜脈異常連接。SEMA3D 信號(hào)通路的基因突變將是研究先心病和TAPVC 連接一個(gè)重要的突破點(diǎn)，其與TAPVC 關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

2.4 視黃醇結(jié)合蛋白5（retinol binding protein 5，RBP5）

RBP5，調(diào)節(jié)維生素A 的表達(dá)，參與視黃醇結(jié)合蛋白信號(hào)通路，該通路與肺靜脈的起源[20]，即第二生心區(qū)發(fā)育有關(guān)。定位于12p13。Nash 等[10]對(duì)5 個(gè)相關(guān)的TAPVR 患者作SNP 分析，全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)在RBP5 的某片段發(fā)現(xiàn)一個(gè)非同義突變的位點(diǎn)RBP5 E70Q。RBP5 基因預(yù)測(cè)是有害的，并且在TAPVC 人群中過(guò)表達(dá)。對(duì)斑馬魚注射與人類RBP5同源的基因RBP7a morpholino 及mRNA 進(jìn)行敲降與補(bǔ)救試驗(yàn)。rbp7a 敲降的斑馬魚整體外觀是正常的，但出現(xiàn)反向心臟循環(huán)的表型，異常右側(cè)心臟環(huán)化占42%。共同注射morpholino RBP7a 和人類RBP5 信使RNA 作補(bǔ)救試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些RNA 過(guò)表達(dá)導(dǎo)致斑馬魚環(huán)化異常的現(xiàn)象消失，表明正確表達(dá)量的視黃酸的表達(dá)對(duì)心臟左右不對(duì)稱結(jié)構(gòu)正常發(fā)育是至關(guān)重要的。有研究者推測(cè)其他基因突變可能與RBP E70Q 共同導(dǎo)致肺靜脈的異常連接，如NODAL（由視黃酸信號(hào)通路調(diào)節(jié)的基因，與心臟左右不對(duì)稱模式相關(guān)）和視黃醇脫氫酶10（RDH10，與視黃酸新陳代謝有關(guān)），并且在TAPVC 患者身上得到了驗(yàn)證。這些證據(jù)支持視黃酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑不同基因之間的遺傳相互作用，并證實(shí)先天性心臟缺陷是多因素共同作用的觀點(diǎn)[21]。另外，也應(yīng)考慮環(huán)境因素，如飲食中維生素A 的攝入量。已經(jīng)確定的是在加拿大人中維生素A 攝入不足會(huì)引起先心病[22]，而且TAPVC 發(fā)生率大幅提高。本研究中借助斑馬魚模型初步出現(xiàn)心臟異常表型，Nash 認(rèn)為用斑馬魚進(jìn)一步使用Crispr/cas9 技術(shù)敲入人類基因是研究這種多基因人類遺傳疾病突變的理想模型，也是研究TAPVC發(fā)病機(jī)制很有前景的研究手段。

2.5 激活素受體酶1（activin receptor like kinase 1，ACVRL1）和δ-肌聚糖基因（sarcoglycan delta，SGCD）

ACVRL1 是TGF 超家族配體的細(xì)胞表面受體，定位于12q13，調(diào)控血管的發(fā)育。肌聚糖基因（Sarcoglycan Delta，SGCD），定位于5q33，南京兒童醫(yī)院的研究人員在國(guó)內(nèi)首次用全外顯子測(cè)序方法對(duì)6 個(gè)TAPVC 患者和81 非TAPVC 對(duì)照患者進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)了2 個(gè)非同義突變，ACVRL1 c.C652T，p.R218W 和SGCD c.C717G，p.D239E[5]。有 報(bào) 道ACVRL1 的C652T 位點(diǎn)突變導(dǎo)致Galen 靜脈動(dòng)脈瘤畸形（VGAM）[23]。而ACVRL1 的T649G（p.T217G），G650A（p.W217X）[24]和G656A（p.G219H）這些位點(diǎn)突變與肺動(dòng)脈高壓有關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)所有測(cè)序的TAPVC 患者都伴有肺動(dòng)脈高壓，手術(shù)之后都會(huì)恢復(fù)，因而推斷ACVRL1 這些位點(diǎn)突變可能與TAPVC發(fā)病相關(guān)。雖然之前沒有報(bào)道過(guò)SGCD 與TAPVC相關(guān)，SGCD（c.C717G，p.D239E）位點(diǎn)突變?cè)谝晃换颊呱砩显俅螜z測(cè)到。在6 位測(cè)序患者中有2 位發(fā)現(xiàn)SGCD C717G 突變，并在1 位患者身上驗(yàn)證了此突變位點(diǎn)，而81 個(gè)對(duì)照患者并沒有此突變。因此，推測(cè)SGCD C717G 位點(diǎn)突變有可能與TAPVC 相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ACVRL1 和SGCD 點(diǎn)突變的是TAPVC 致病基因，需要進(jìn)一步的功能驗(yàn)證和樣本分析。全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)給TAPVC 的臨床診斷帶來(lái)重要的價(jià)值。

2.6 其他

已有報(bào)道GATA4 結(jié)合蛋白（GATA binding protein 4，GATA4）K319E 位 點(diǎn) 突 變[11]、TBX20.I121F 位點(diǎn)突變與TAPVC 相關(guān)聯(lián)[12]。文獻(xiàn)中有關(guān)TAPVC 的候選基因的報(bào)道總結(jié)表1。

3 結(jié)語(yǔ)

心臟形態(tài)的形成是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，一系列基因參與其中，先心病的基因研究是探索心臟發(fā)育分子機(jī)制至關(guān)重要的部分。TAPVC 作為一種罕見的先心病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因與TAPVC 相關(guān)，但是大部分基因是由人類遺傳學(xué)方法篩查出來(lái)的，其是否能夠真正導(dǎo)致TAPVC，其導(dǎo)致TAPVC 發(fā)生的具體機(jī)制仍需要更多的功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。另外，是否有其它新的基因可能闡釋TAPVC 的發(fā)病機(jī)理，可以借助對(duì)發(fā)病群體進(jìn)行全基因組、全外顯子測(cè)序等手段進(jìn)行篩查。對(duì)TAPVC發(fā)病的胚胎發(fā)育研究、分子病因?qū)W進(jìn)行探索，對(duì)于TAPVC 疾病的預(yù)防、治療具有重要的臨床指導(dǎo)意義。