吳慧珍 王洋 謝正露

關(guān)鍵詞：哺乳動物;精子;鞭毛;雄性不育;分子遺傳學(xué)

精子良好的運動性是雄性正常生育能力的核心部分。精子運動活力低下或無活力的個體通常沒有生育能力，除非借助先進的生殖技術(shù)輔助。目前，對于臨床上弱精子癥的發(fā)病機制仍知之甚少，除少數(shù)單基因缺陷（主要見于人類和實驗動物）和一些明顯的睪丸損傷原因，如創(chuàng)傷、熱休克或射精后精子的儲存外，導(dǎo)致弱精子癥的根本原因還不為人知，因此對其進行的治療也是非特異性的。對于改善育種管理，比如通過配子輸卵管內(nèi)移植（GIFT）或體外受精（IVF）技術(shù)、單精子卵泡漿顯微注射（ICSI）等在臨床上使卵子受精也是較為常見的方法。因此，弱精子癥通常是精子活力低下的臨床表現(xiàn)，而不是導(dǎo)致不育的真正診斷。

若僅依靠輔助生殖技術(shù)解決雄性不育問題，對精子中異常的基因及合成蛋白導(dǎo)致的不育不重視，可能無意中會讓缺陷基因遺傳給后代。因此，完整地了解關(guān)于運動精子的分子過程，對臨床上更有效地解決精子運動能力的降低和相關(guān)低生育能力的問題，最終使弱精子癥得到治療甚至治愈具有重要意義，如通過刺激相關(guān)信號通路或基因治療，而不是簡單地利用ICSI逃避這個問題。另外，了解裝配和調(diào)節(jié)功能性精子鞭毛需要的特定蛋白，也許能夠人為地破壞其關(guān)鍵功能，從而開發(fā)一種安全高效的雄性避孕藥。本文通過回顧對哺乳動物鞭毛功能和精子運動機制的認識，通過對不同動物模型（包括小鼠、大鼠、倉鼠等物種模型）的系統(tǒng)分析，了解到哺乳動物精子功能的潛在機制往往高度保守，這些對于進一步研究精子導(dǎo)致的不育機制研究具有重要作用。

1 哺乳動物精子運動的2種類型

大部分哺乳動物精子有2種生理性運動：（1）新射精的精子中所見的激活運動;（2）受精部位的大部分精子中可見的超激活運動[1-2]。激活運動精子鞭毛產(chǎn)生對稱性、低振幅擺動，驅(qū)動精子在精漿或稀釋精液這種相對無黏性的環(huán)境中以近直線方式運動。大鼠試驗證實激活鞭毛擺動提供的動力促進精子穿過雌性生殖道[3]。即使一些無運動性的精子到達了輸卵管（可能是雌性動物生殖道收縮的結(jié)果），大部分缺乏動力的精子依然不能夠到達子宮輸卵管交界處，因而無法在體內(nèi)受精。精子到達輸卵管后的某一時刻，鞭毛擺動的模式會變成具有不對稱性的高振幅擺動，精子在精漿或稀釋的精液中靜止時呈圓形或8字形軌跡[4]，這種模式被稱作“超激活運動”。近年來，研究表明在輸卵管較黏稠的環(huán)境中超激活精子運動呈相對直線游動。相反，激活精子鞭毛的擺動不足以推動精子通過輸卵管。超激活運動的生理學(xué)作用是幫助精子擺脫輸卵管上皮細胞[5]，在輸卵管環(huán)境中逐漸移動到受精的位置。此外，超激活運動可能有助于精子穿透卵子。在對嚙齒類動物的研究中發(fā)現(xiàn)，超激活精子運動也與精子在體外受精的能力有關(guān)[6-7]。因此，1個精子必須具備激活運動和超激活運動的能力以使卵子受精。如果這些事件沒有在適當時間和地點發(fā)生，雄性的生育能力將顯著降低。

在臨床中我們通常通過處理新鮮的新射精精子評估激活運動，目前還沒有先進的臨床方法來誘導(dǎo)生理性的超激活運動，因此這種運動形式也很少在臨床樣本上檢查到。目前，在臨床上主要解決的是關(guān)于激活運動問題，故本文將主要綜述激活運動的調(diào)節(jié)機制，及與超激活相關(guān)的具體項目。

2 精子鞭毛的超顯微結(jié)構(gòu)

精子運動的“正常的鞭毛”超顯微結(jié)構(gòu)對其功能至關(guān)重要。鞭毛的4個主要超微結(jié)構(gòu)亞區(qū)為：連接段、中段、主段和末端[8]。連接段是鞭毛最短的部分，連接到精子頭部細胞核的植入窩。在這點上，從中心粒的剩余部分開始，鞭毛軸絲延伸到鞭毛的4個亞區(qū)。鞭毛軸絲由圍繞中心微管的9組二聯(lián)微管組成。內(nèi)、外動力蛋白臂分別由9對外周二聯(lián)微管發(fā)散出來，這些蛋白臂負責產(chǎn)生鞭毛的動力[9]。此外，分別來源于9對外周二聯(lián)微管的9個軸幅向內(nèi)以螺旋狀在中心微管周圍排列。

中段是僅次于連接段最接近頭部的部分，約占鞭毛長度的1/4～1/3。中段是由9個外周致密纖維（ODF）和包圍ODF的線粒體鞘（MS）形成。ODF延伸整個中段并進入主段部分，而MS只存在于中段部分。中段的終環(huán)標志中段的結(jié)束和下一個鞭毛組成部分主段的開始，主段約占鞭毛總長度的 2/3。在主段的開始即線粒體鞘的結(jié)束部位，2個ODF被2個纖維鞘（FS）取代，ODF的數(shù)量從9個減少至7個。FS是主段獨有的結(jié)構(gòu)，延伸整個主段，ODF的外周圓形縱向肋保證其穩(wěn)定性。當主段接近終止時，ODFs和FS逐漸變細并最終消失。鞭毛的尾端被稱為末端，只包含由細胞膜包圍的鞭毛軸絲。

鞭毛軸絲在所有含有纖毛和鞭毛的真核細胞中高度保守。MS、ODFs和FS是哺乳動物精子鞭毛特有的附屬結(jié)構(gòu)（圖1）[10]。盡管組成這些結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的編碼基因中有一些已被克隆并進行特征描述，但大多數(shù)仍只是表面上的描述或完全沒有被識別。

2.1 鞭毛軸絲

鞭毛是所有真核生物纖毛和鞭毛運動的“馬達”。在綠藻中，已有超過200種鞭毛軸絲和與軸絲相關(guān)蛋白被描述，哺乳動物的鞭毛軸絲與其相比復(fù)雜程度至少一樣。在哺乳動物精子中α哺乳微管蛋白是迄今為止最重要的鞭毛軸絲蛋白[13]，當腺苷三磷酸酶被激活時，它會導(dǎo)致相應(yīng)外周鞭毛軸絲雙微管的滑動，隨著雙微管一個接另一個滑動，鞭毛發(fā)生彎曲[14]。鞭毛軸絲蛋白的缺陷可導(dǎo)致鞭毛軸絲的異常組裝和擺動，在綠藻的軸絲蛋白上進行大量的誘變試驗，因此許多軸絲蛋白的缺陷已被證明可導(dǎo)致鞭毛缺乏運動性[15]。由于鞭毛軸絲存在于所有的真核生物細胞中，哺乳動物的鞭毛軸絲紊亂可導(dǎo)致臨床癥狀，包含除精子外的其他類型的纖毛細胞。在人類和一些家畜中由軸絲排列異常導(dǎo)致的疾病已有研究，如鞭毛軸絲缺陷可導(dǎo)致精子活力低下或缺失，并伴有不育，如原發(fā)性纖毛細胞運動障礙[16];若排列異常影響到聽覺毛細胞則會導(dǎo)致亞瑟氏綜合征[17];當缺陷涉及視網(wǎng)膜的改良纖毛細胞時會導(dǎo)致失明[18]。

2.2 外周致密纖維

ODFs第一個可疑作用是精子尾部的結(jié)構(gòu)支撐，角蛋白樣中間絲狀體ODF蛋白編碼基因的成功克隆為這一假說提供支持[19-21]。有研究表明，ODF對細胞骨架的構(gòu)建和細胞分裂發(fā)育有重要作用。ODF與精子鞭毛功能受損有關(guān)，進而影響精子的獲能，這說明ODF并非只是單一的結(jié)構(gòu)蛋白。

2.3 線粒體鞘

ATP作為鞭毛運動的能量來源，精子軸絲運動蛋白對ATP有較高需求。與其他細胞一樣，精子線粒體通過有氧呼吸產(chǎn)生ATP。線粒體被終環(huán)限制只存在于精子中段的線粒體鞘中，而軸絲卻貫穿整個鞭毛，如果線粒體ATP是軸絲唯一的能量來源，那么它必須擴散一段距離才能為整個軸絲充分供應(yīng)能量。使用ATP擴散常數(shù)和地貌形態(tài)示量預(yù)估的小鼠精子鞭毛線粒體體積[22]，數(shù)學(xué)模型表明，在中段產(chǎn)生的ATP是不足以擴散至尾端以滿足動力蛋白的能源需求。此外有研究表明，小鼠不依賴線粒體的氧化磷酸化仍可發(fā)生受精[23]，精子仍能產(chǎn)生ATP（低于野生型精子水平）且具有活力，盡管水平有所降低[24]。這些數(shù)據(jù)表明線粒體氧化磷酸化并不是支持鞭毛運動ATP的主要來源。

2.4 纖維鞘

與ODFs一樣，F(xiàn)S在精子運動中起著機械性作用，它為鞭毛提供有力支撐，并決定了鞭毛的平面運動[25]。FS的2個縱向肋連同外周縱向肋，形成了1個“工字梁”狀結(jié)構(gòu)，軸絲微管可以沿此軌道滑動，這種滑動形式具有cAMP依賴性，特別是cAMP依賴性的蛋白激酶A（PKA）參與[26]。由于越來越多參與精子運動信號通路和代謝的蛋白定位于FS，除了結(jié)構(gòu)支撐作用外，F(xiàn)S在鞭毛運動調(diào)控中可發(fā)揮更直接作用。有研究表明，氧化應(yīng)激可干擾精子活力和損傷DNA，至少有1種FS蛋白可以保護精子免受氧化應(yīng)激的影響[27]。基于這些數(shù)據(jù)，現(xiàn)在普遍認為FS是對鞭毛功能至關(guān)重要的多種信號通路和代謝級聯(lián)反應(yīng)的支架和中心。

精子特異性GAPD-S是一種定位于FS上的酶，其靶向缺失可導(dǎo)致雄性不育，與精子活力異常緊密相關(guān)。許多哺乳動物的FS上可鑒定到糖酵解酶，如己糖激酶、乳酸脫氫酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶[28]。在某些情況下，這些酶的亞型是精原細胞特有的。此外，GAPD-S下游的所有糖酵解酶在去除膜后仍附著在細胞骨架上，表明它們是FS或ODFs的組成部分[29]。精子尾部最重要的ATP來源是在精子鞭毛主段上進行的糖酵解，而不是通過中段的氧化磷酸化途徑[30]。基因敲除小鼠研究表明，主段上糖酵解產(chǎn)生ATP是超激活運動的必要條件，而抑制氧化磷酸化并不會阻礙受精[31]。

2.5 隨著鞭毛的拍擊游動

當軸絲動力蛋白臂磷酸化時，動力蛋白ATP酶被激活，ATP水解驅(qū)動動力蛋白臂鄰近的雙微管一個接一個滑動[14，32]，由于軸絲被錨定在精子頭部底端，這種滑動力被轉(zhuǎn)化為鞭毛的彎曲運動。鈣調(diào)蛋白依賴性的磷酸酶鈣調(diào)蛋白的去磷酸化可使這一過程發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

動力蛋白臂產(chǎn)生單向力，相關(guān)動力蛋白臂的磷酸化和去磷酸化及激活和失活在整個軸絲周圍上以異步方式發(fā)生，使軸絲產(chǎn)生正常彎曲。每一個動力蛋白臂與鄰近的雙微管相互作用，產(chǎn)生一個動力使雙微管彎曲，然后釋放雙微管，這樣軸絲就可以回到它的原始位置并再次向相反方向彎曲。

3 精子運動的調(diào)控機制

通常認為cAMP/PKA和鈣信號通路是調(diào)控哺乳動物精子活力最重要的2個信號通路[33]。異三聚體和微蛋白介導(dǎo)的通路及pH值的變化也對精子運動起作用[34]，但這些機制在成熟精子中還未清楚地表述。

3.1 cAMP/PKA

環(huán)磷酸腺苷依賴性的鞭毛蛋白負責一部分哺乳動物精子激活運動的啟動和維持。在小鼠中，cAMP依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化亞基的靶向缺失會表現(xiàn)出不育，可能是通過cAMP激活PKA影響精子的運動[35]。雖然PKA可能通過多種途徑控制鞭毛功能，但其中一個作用機制是激活下游PKA靶蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸化傳遞介導(dǎo)胞外信號，影響精子活力。到目前為止，只有少數(shù)PKA磷酸化蛋白靶點在精子中被確定。已知的一個重要的蛋白靶點是軸絲動力蛋白臂，正如前文所述，其磷酸化是鞭毛運動啟動的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)點。除調(diào)節(jié)PKA通路外，cAMP還可激活精子中的其他信號通路，如環(huán)核苷酸門控離子通道、cAMP介導(dǎo)的鳥嘌呤核苷酸交換因子。

鞭毛蛋白的酪氨酸酶磷酸化和去磷酸化與靈長類動物和嚙齒類動物精子運動的啟動和結(jié)束有關(guān)。其中一種含有酪氨酸酶磷酸化的蛋白是A激酶錨定蛋白（AKAP）。AKAPs是負責將PKA和其他蛋白錨定并作用于底物，催化靶蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸化的一類蛋白家族，AKAP介導(dǎo)的靶蛋白的變化與調(diào)節(jié)精子激活運動有關(guān)[36]。此外，pH值可通過胞內(nèi)HCO3-/sNHE-sAC-cAMP-PKA信號通路調(diào)控精子鞭毛上運動相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白的磷酸化水平從而影響精子鞭毛的擺動模式。

3.2 鈣信號

具有活力的精子樣本中需要添加胞外鈣，眾所周知，鈣可調(diào)節(jié)激活運動和超激活運動[37]。鈣通過調(diào)節(jié)可溶性腺苷環(huán)化酶（sAC）影響鞭毛功能，sAC通過水解ATP生成cAMP來激活PKA。因此，鈣信號通過sAC可作為通路的一部分與PKA信號連接起來，進一步引發(fā)PKA介導(dǎo)的cAMP/PKA信號通路調(diào)控精子活動[38]，精子使鞭毛內(nèi)鈣含量增加的機制尚不完全清楚。細胞內(nèi)部鈣儲備可能是原因之一，特別是在超激活化運動的調(diào)控中。與體細胞不同，除頂體外，精子鞭毛中無明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，故沒有胞內(nèi)鈣儲備。精子頸部的冗余核膜被認為是細胞內(nèi)鞭毛鈣的來源之一[39]。大量研究表明，除了胞內(nèi)儲存，胞外鈣離子通過膜通道進入精子是影響細胞內(nèi)鈣水平變化的另一種方式[40]。

環(huán)核苷酸門控通道（CNGC）可能在鞭毛的不同微區(qū)產(chǎn)生不同的鈣內(nèi)流模式[41]，這些通道的不同亞單位在精子中以不同的時間和空間模式存在。CNGC的羧基末端與cGMP和cAMP結(jié)合激活該通道，雖然在精子中CNGC對cGMP最敏感，它對cAMP的反應(yīng)表明其與精子主要的運動調(diào)節(jié)通路（PKA和鈣信號）有關(guān)?；蚯贸芯恳矠榘忖}在胞膜上轉(zhuǎn)運為精子運動所必需而提供強有力的證據(jù)。CatSper Ⅰ門控陽離子通道定位于成熟精子主段[42]，是cAMP誘導(dǎo)鈣離子流入精子所必需的[43]。CatSper Ⅰ基因的靶向缺失可導(dǎo)致精子細胞內(nèi)的cAMP刺激消失，使胞內(nèi)鈣降低從而導(dǎo)致精子活力降低。在精子鞭毛中有另一個相關(guān)電壓門控鈣通道（CatSper Ⅱ），針對性地敲除CatSper Ⅱ基因會導(dǎo)致雄性不育，這與精子缺乏超激活運動有關(guān)[43]。由此可見，通道介導(dǎo)的胞外鈣進入到鞭毛對激活運動和超激活運動均為必需。T型鈣通道的亞型Cav2.3（α1E）靶向缺失的小鼠，盡管具有生育能力，但在精子胞內(nèi)鈣瞬時轉(zhuǎn)變過程中表現(xiàn)異常，與野生型精子相比其精子線性度也存在差異。以上數(shù)據(jù)為膜通道在鞭毛功能調(diào)控發(fā)揮重要作用提供了進一步的證據(jù)。

3.3 鈣/鈣調(diào)蛋白-鈣調(diào)蛋白激酶

鈣調(diào)蛋白是一種在真核細胞中普遍存在的胞內(nèi)鈣受體，因為抑制CaM會降低精子的活力[44]，鈣對鞭毛的某些影響可能通過CaM實現(xiàn)。研究表明，ATP可刺激PKA恢復(fù)CaM抑制的精子的活力。sAC作為Ca2+的傳感器，激活sAC可使cAMP濃度升高調(diào)節(jié)精子運動，但CaM對精子運動的影響并不是通過sAC實現(xiàn)，所以鈣對sAC的影響與CaM無關(guān)。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)顯示至少存在2個不同的鈣通道，其中一個是通過sAC這種環(huán)化酶實現(xiàn)（如sAC/PKA），另一個是通過CaM。由于sAC基因的缺失導(dǎo)致精子運動性降低，由此得出鈣離子/CaM不能補償sAC喪失的功能。然而，當CaM受到抑制時，PKA通路的激動劑可恢復(fù)精子運動，故sAC通路的成分可彌補鈣/鈣調(diào)蛋白激酶功能的喪失。

鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）是CaM的下游目標。鈣離子和CaM結(jié)合后激活CaMK，激活的CaMK促使cAMP增加從而啟動精子運動[45]，使用CaMK的抑制劑可降低精子活力[46]。所以CaM對精子運動的影響可能是通過激活鞭毛中的CaMK。有研究已將CaM與T型鈣通道在精子中的調(diào)節(jié)聯(lián)系在一起[47-48]，鈣調(diào)蛋白是一種鈣離子/CaM依賴的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，也參與鞭毛運動的調(diào)節(jié)。因此，CaM/CaMK是哺乳動物精子運動中鈣通路調(diào)節(jié)的成分。

3.4 時間與空間上的精準調(diào)控

精子是一種高度分化的細胞，參與頂體反應(yīng)的蛋白質(zhì)必須定位于頂體。卵質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)在精子的赤道部區(qū)域結(jié)合。在精子運動過程中需要的蛋白質(zhì)必須定位到成熟精子的尾部，可使用AKAPs劃分蛋白質(zhì)。AKAPs是一個蛋白家族，其功能是將PKA連接至特定的亞細胞區(qū)域。AKAPs將PKA栓在鞭毛FS上，從而將激酶的作用范圍限制在與運動相關(guān)靶點附近的軸絲內(nèi)（圖2）[49-50]。

在這方面，小鼠精子FS的主要蛋白是AKAP4[46]。目前，已知AKAPs是多種哺乳動物FS/主段的主要組成部分，這表明在進化上它們在鞭毛功能中的作用是保守的[51]，因此也表現(xiàn)出其關(guān)鍵性。通過AKAPs將蛋白質(zhì)解離在鞭毛的不同位置，可以確保合適的蛋白質(zhì)在適合時間、適合位置表現(xiàn)鞭毛功能。小鼠AKAP4基因靶向突變使精子活力嚴重降低，證明AKPA錨定蛋白對鞭毛功能的重要性。PKA 2型調(diào)節(jié)亞基的靶向缺失及與其相關(guān)的PKA催化亞基錨定缺失，對小鼠的精子活力或生育能力沒有明顯影響[52]，這似乎與精子運動需要PKA錨定（假設(shè)是通過AKAPs）作用的觀點相矛盾，其原因可能是在鞭毛中存在的其他PKA亞型，在2型調(diào)節(jié)亞基失去錨定時對鞭毛產(chǎn)生補償。

在體細胞中，AKAP家族成員是和激酶、磷酸酶一樣的細胞支架。如果這些錨定蛋白在精子中發(fā)揮類似的作用，那么它們可能是調(diào)節(jié)運動所需的磷酸化/去磷酸化通路中的主要調(diào)控因子。

4 導(dǎo)致精子運動異常的原因

目前，研究中獲得的信息很少應(yīng)用到臨床實踐中，但我們可推測出雄性先天性弱精子癥的病因。如果精子尾部的超微結(jié)構(gòu)有明顯的形態(tài)學(xué)缺陷，則正常鞭毛的擺動可能出現(xiàn)機械性問題。通常這些異?？梢酝ㄟ^對精子的常規(guī)形態(tài)學(xué)評估來確定，或者在特殊的情況下使用電子顯微鏡來確定。

精子線粒體蛋白的缺失會導(dǎo)致ATP合成受損，這將對精子功能產(chǎn)生不利影響，因此線粒體功能的測定對蛋白質(zhì)缺失的線粒體是有效的。目前，證據(jù)表明精子的運動并非一定需要鞭毛中段的氧化磷酸化，所以線粒體功能低下未必是精子運動能力弱的主要原因。如果主段中正常糖酵解的臨床試驗?zāi)軌虬l(fā)展起來，可證明糖酵解對精子運動有更直接的影響。

支持精子運動的信號通路相當復(fù)雜，信號通路任何異常都會導(dǎo)致精子活動性下降。例如，細胞膜鈣通道的問題（如敲除catsper的小鼠精子顯示不運動[53]）及PKA信號通路中cAMP數(shù)量的變化（如敲除sAC的小鼠精子表現(xiàn)出不運動[54]）和任何信號通路組成部分發(fā)生的問題（如發(fā)現(xiàn)CaM或CaMK受到抑制的精子運動能力降低[45，55]）。如果類似的問題發(fā)生，那么在臨床病例上極有可能表現(xiàn)為不育。

5 結(jié)論

根據(jù)對精子運動分子基礎(chǔ)上的探討，我們已經(jīng)了解精子運動所需的基因和蛋白質(zhì)種類，這些蛋白包括參與精子結(jié)構(gòu)、鞭毛組裝、鈣信號傳導(dǎo)、蛋白磷酸化和靶向蛋白。但我們還沒有研究精子發(fā)生過程中（例如無精子癥基因DAZ的缺失）或正常生殖道的發(fā)育過程中（如囊性纖維跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子CFTR基因）涉及的基因，在全面解決先天性弱精子癥之前依然還存在許多問題尚待解決。本研究從鞭毛生理學(xué)研究中獲得的信息，將使臨床上治療弱精子癥時，改進其對不育的診斷和具體治療方法。另一方面，也可以通過抑制鞭毛的功能作用從而降低精子的活力，這可以引導(dǎo)我們開發(fā)出一種有效和安全的雄性避孕藥。精子運動調(diào)節(jié)機制的研究在畜牧生產(chǎn)上也具有重要應(yīng)用價值，為人工授精提供理論基礎(chǔ)。

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