李小燕 ，王小中 ，曾選 ，姜玉環(huán)

(1南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江西 南昌330006；2、江西省婦幼保健院輸血科 江西 南昌330006)

新生兒溶血病 (haemolytic disease of the newborn and fetus，HDFN)是指母親和胎兒血型不合導(dǎo)致的胎兒或新生兒的一種免疫性溶血性疾病。胎兒的紅細(xì)胞抗原源自于父親和母親，如果從父親遺傳的那部分紅細(xì)胞抗原是母親所缺少的，那么胎兒的紅細(xì)胞對于母親來說就是一種異抗原，當(dāng)它通過胎盤進(jìn)入母體的血液循環(huán)時，可刺激母體產(chǎn)生免疫性抗體。此抗體經(jīng)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，與胎兒紅細(xì)胞上相應(yīng)的抗原結(jié)合，使紅細(xì)胞溶解破壞進(jìn)而出現(xiàn)新生兒黃疸、貧血、水腫、肝脾腫大，甚至死胎、新生兒死亡等溶血病的癥狀和合并癥[3-4]。我國大部分HDN是由ABO血型不合引起，輕者導(dǎo)致新生兒黃疸、貧血、水腫、肝脾腫大，嚴(yán)重者導(dǎo)致核黃疸以及病死。O型孕婦血清中的IgG型抗-A(B)抗體分子量小，可以經(jīng)過胎盤對含有相應(yīng)抗原的胎兒血液進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致溶血。O型孕婦血清中IgG型抗-A(B)抗體效價或滴度越高，胎兒發(fā)生新生兒 ABO 溶血癥的概率越大[1，4，9]。 檢測孕婦的 IgG抗A(B)抗體效價可以協(xié)助臨床預(yù)測胎兒或新生兒HDFN的發(fā)生，以及O型婦女反復(fù)流產(chǎn)的原因分析。本研究采用一種簡易的方法和傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法平行檢測O型婦女血清中的IgG抗A(B)效價，分析兩種檢測結(jié)果的差異，探討簡易方法在O型孕婦或O型反復(fù)不良孕產(chǎn)史婦女產(chǎn)前檢查IgG抗體效價的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2018年5月-2018年12月在本院門診或住院做產(chǎn)前或孕前檢查的O型婦女，其丈夫均為非O型，做孕前檢查的包括有反復(fù)流產(chǎn)史的婦女流產(chǎn)原因檢查。年齡在16～45歲。身體健康，無肝腎及血液系統(tǒng)疾病，不規(guī)則抗體陰性。送檢抗A效價103例，送檢抗B效價105例，送檢抗A/B效價69例。用簡易方法和傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法平行檢測共346個抗A(B)效價，其中抗A共172例，抗B共174例。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 離心機(jī) (日本久保田KA-2200)，水浴箱 (上海精宏醫(yī)療器械DK-BB)，0.2mol/L2-Me、2%～5%標(biāo)準(zhǔn)A、B型紅細(xì)胞懸液、抗人球蛋白試劑(上海血液生物醫(yī)藥有限公司)

1.2.2 標(biāo)本預(yù)處理 取200ul婦女血清標(biāo)本和200ul0.2mol/L2-Me應(yīng)用液充分混勻，試管加塞置37℃水浴箱溫浴 15～30min[2-3]。

1.2.3 簡易方法 取一支試管，標(biāo)記，取100ul處理好的血清及50ul2%～5%標(biāo)準(zhǔn)A(B)細(xì)胞加入試管，混勻，置37℃水浴箱溫浴60min后不離心輕搖試管肉眼觀察紅細(xì)胞凝集情況，依據(jù)凝集強度判斷相應(yīng)效價。具體強度及相應(yīng)效價判斷方法如下：

無凝集紅細(xì)胞，即細(xì)胞呈細(xì)沙狀無凝集顆粒：判斷效價≤32

紅細(xì)胞有+-強度凝集，即有肉眼可見的細(xì)小凝集顆粒，底液渾濁：判斷效價64

紅細(xì)胞有1+強度凝集，即有較粗凝集顆粒，底液渾濁：判斷效價128

紅細(xì)胞有2+強度凝集，即有較粗凝集顆粒，且底液清亮：判斷效價256

紅細(xì)胞有3+強度凝集，即凝集顆粒大塊，帶有少許小塊，底液清亮：判斷效價512

紅細(xì)胞有4+強度凝集，即凝集顆粒為整塊，底液清亮：判斷效價≥1024

1.2.4 傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法 取十支試管標(biāo)記，從第 2 管(1：4)至第 10 管(1：1024)每管加 200μl生理鹽水，陰性對照管加100μl生理鹽水。向倍比稀釋管中加入200μl處理后的血清做倍比稀釋。取每個稀釋度的待檢血清100μl，加入50μl2%～5%標(biāo)準(zhǔn) A(B)細(xì)胞，900～1000g 離心 15s，觀察 IgM 是否中和徹底，將鹽水介質(zhì)不出現(xiàn)凝集的管，重新輕搖混勻后做間接抗人球蛋白實驗。具體細(xì)節(jié)參考文獻(xiàn)[2-3]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 簡易法與傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法檢測結(jié)果取稀釋倍數(shù)為數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件分析。兩種方法陽性檢出率比較采用四格表配對資料χ2檢驗驗證，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時做直線相關(guān)與直線回歸分析并建立回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法平行檢測IgG抗A(B)效價結(jié)果比較簡易法和傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法平行檢測172例IgG抗A效價，結(jié)果完全一致113例，概率為65.70%(113/172)，相差一個稀釋度46例，概率為26.74%(46/172)，相差一個稀釋度以內(nèi)概率為92.44%，相差兩個及以上稀釋度13例，概率為7.56%(13/172)。平行檢測抗B效價174例，結(jié)果完全一致115例，概率為66.09%(115/174)，相差一個稀釋度44例，概率為25.29%(44/1742)，相差一個稀釋度以內(nèi)概率為91.38%，相差兩個及以上稀釋度15例，概率為8.62%(15/174)。見表1。

2.2 兩種方法平行檢測IgG抗A(B)效價 以IgG抗A(B)抗體效價≥64為陽性值判斷，簡易法和傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法檢測IgG抗A抗體效價的陽性率分別為 62.79%(108/172)，66.86%(115/172).兩種方法陽性率用卡方檢驗，(χ2=2.0,P＞0.05)無統(tǒng)計學(xué)意義,兩種方法檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。抗B抗體效價的陽性率分別為47.12%(82/174)，62.07%(108/174).兩種方法陽性率用卡方檢驗，(χ2=2.0,P＞0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義，兩種方法檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。見表2。

表1 兩種方法平行檢測IgG抗A(B)效價結(jié)果比較

表2 以效價≥64為陽性，兩種方法檢測抗A(B)效價的陽性檢出率

2.3 兩種方法相關(guān)性分析 效價前后相差一管被認(rèn)為可以接受值[2]，兩種方法檢測抗A相關(guān)性分析結(jié)果：兩種方法檢測結(jié)果具有相關(guān)性 (r=0.93，P＜0.01)，回歸方程為Y=0.964X+0.05，檢測抗 B相關(guān)性分析結(jié)果：兩種方法檢測結(jié)果具有相關(guān)性 (r=0.91，P＜0.01)，回歸方程為 Y=0.918X-0.015。 見表3。

表3 兩種方法平行檢測IgG抗A(B)效價

3 討論

新生兒溶血病(HDN)以AB0和Rh系統(tǒng)最為常見。新生兒溶血病是導(dǎo)致新生兒黃疸、貧血、水腫、肝脾腫大的重要因素[8]，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死胎、新生兒死亡。ABO不和的妊娠比例為20%～25%，其中發(fā)病的占10%。ABO HDN多見為0型母親所生的A型或B型胎兒，第1胎即可發(fā)病[1]。自20世紀(jì)以來測定IgG抗-A(B)抗體效價的方法國內(nèi)外推薦的方法為經(jīng)典抗人球蛋白法[3-4]。經(jīng)典抗人球蛋白法檢測步驟比較繁瑣，耗時。目前國內(nèi)外均生產(chǎn)出微柱凝膠卡以及凝聚胺試劑盒，也在國內(nèi)取得了檢測認(rèn)可。目前國內(nèi)檢測IgG抗-A(B)抗體效價的方法有經(jīng)典抗人球蛋白法、微柱凝膠法、凝聚胺法。這些方法各有特點，經(jīng)典抗人球蛋白法一直被視為標(biāo)準(zhǔn)方法，其特點是過多的洗滌步驟，較長的孵育時間，使得該方法較繁瑣、費時，且難以自動化和標(biāo)準(zhǔn)化以及對檢測人員的操作手法要求較高。微柱凝膠卡法具有操作簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果可保存等優(yōu)點，且方便快捷利于臨床推廣。但近年來的研究表明微柱凝膠卡法在檢測紅細(xì)胞抗體效價方面與經(jīng)典抗人球蛋白蛋白法相比具有更高的敏感性而需要重新界定參考值，且價格昂貴使得該方法難以得到廣泛推廣。凝聚胺法近年來在血型血清學(xué)中被逐漸采用，其基礎(chǔ)也是抗球蛋白法，凝聚胺是一種多價陽離子聚合物，在低離子介質(zhì)中可促進(jìn)紅細(xì)胞和血清之間的抗原抗體反應(yīng)使試驗靈敏度提高。但它在實驗溫度較低或患者含冷抗體時凝集會變得更強而會干擾實驗結(jié)果[5，6]。以上方法均需要對處理后血清做系列倍比稀釋，步驟繁瑣，樣本量大時操作難度較大。本研究的簡易法操作簡便，實驗成本低廉。

另外，抗體效價檢測方法僅為半定量技術(shù)。所用技術(shù)的不同，在很大程度上可影響反應(yīng)結(jié)果。移液技術(shù)及移液量的大小都將影響抗體效價結(jié)果[2]。采用經(jīng)典抗人球蛋白法重復(fù)檢測同一實驗標(biāo)本結(jié)果一致率也僅為79%，相差一個滴度以內(nèi)概率為92%[7]。本研究的簡易方法更為簡便，適用于產(chǎn)前批量篩檢O型婦女IgG抗-A(B)抗體效價，該方法和傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法相比有較好的一致性及重疊性。在進(jìn)行O型婦女產(chǎn)前IgG抗A(B)抗體效價檢測時，可在使用經(jīng)典抗人球蛋白法時或凝膠卡等其他方法時加做簡易法，兩種方法結(jié)果相互驗證以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。但本研究范圍僅限于檢測O型孕婦或因抗體效價高而引起反復(fù)流產(chǎn)的O型婦女的IgG型抗A(B)抗體效價，針對小于32的效價值需要用傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法或凝膠卡等方法來測定。