基于發(fā)酵過程的淡豆豉6種黃酮類成分質(zhì)量控制研究

李鷙，曹冬英，許文，褚克丹，隋利強(qiáng)，徐偉

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建省中藥炮制技術(shù)傳承基地，福建 福州 350122)

淡豆豉是以豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]為主料，以桑葉、青蒿為輔料經(jīng)過發(fā)酵加工而成的制品。性苦、辛，涼。歸肺、胃經(jīng)。中醫(yī)理論認(rèn)為淡豆豉具有解表，除煩，宣發(fā)郁熱的功效，可用于感冒，寒熱頭痛，煩躁胸悶，虛煩不眠的癥狀[1]。淡豆豉主要活性成分為黃酮、皂苷、蛋白、多糖、氨基酸、纖溶酶和揮發(fā)性等化合物[2-6]。其中，黃酮類成分中的大豆苷具有明顯的抗骨質(zhì)疏松作用[7]，黃豆黃苷具有較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性[8]，染料木苷具有抗腫瘤和抗氧化活性[9]，大豆苷元具有顯著的抗菌活性和降血糖作用[10-11]，黃豆黃素具有促成骨細(xì)胞增殖[12]和抗氧化能力，染料木素也具有明顯抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗肝纖維化和改善更年期癥狀等藥理活性[13]。淡豆豉中的黃酮類成分被認(rèn)為是其主要活性成分，其分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩類，本試驗對市場上購買及企業(yè)收集的淡豆豉的6種黃酮類成分的含量進(jìn)行比較，建立能同時測定其中多種指標(biāo)成分的方法，對于其質(zhì)量控制和確保療效具有重要的意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1260 型高效液相色譜儀(美國Angilent公司)；CPA225D 型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；KQ-500E 臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試藥 對照品大豆苷(批號：MUST-16031507)、黃豆黃苷(批號：MUST-17032503)，染料木苷(批號：MUST-16021802)、大豆苷元(批號：MUST-17101202)、黃豆黃素(批號：MUST-17092210)、染料木素(批號：MUST-15090908)均購自成都曼思特生物科技有限公司，以上標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。淡豆豉樣品(編號為S1～S13)和淡豆豉原料黑豆(編號為S14)分別在市場和企業(yè)中收集，S1～S14信息詳見表1。甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；甲酸為色譜純(上海阿拉丁試劑有限公司)，其余試劑均為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，5%～5% A；5～8 min，5%～30% A；8～15 min，30%～40% A；15～20 min，40%～60% A；20～30 min，60%～70% A；30～33 min，70%～5% A；33～38 min，5%～5% A)，柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長254 nm。在此色譜條件下6種對照品理論板數(shù)均大于5 000，色譜峰對稱性良好(見圖1)。

A.混合對照品；B.供試品 1.大豆苷；2.黃豆黃苷；3.染料木苷；4.大豆苷元；5.黃豆黃素；6.染料木素

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素對照品適量，精密稱定，加入甲醇超聲溶解，制成質(zhì)量濃度分別為1.056、1.112、0.968、1.024、0.134和1.024 mg·mL-1的單一對照品儲備液，備用。分別精密量取上述對照品溶液適量，置同一容量瓶中，加入50%甲醇至刻度，即得大豆苷52.8 μg·mL-1、黃豆黃苷55.6 μg·mL-1、染料木苷48.4 μg·mL-1、大豆苷元51.2 μg·mL-1、黃豆黃素53.6 μg·mL-1和染料木素51.2 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取淡豆豉粉末約2 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率50 kHz)，放冷，再次稱重，甲醇補(bǔ)足減失重，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.3 線性范圍考察 取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的混合對照品溶液，用50%甲醇稀釋配制為不同梯度濃度的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。以大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果見表2。

表2 淡豆豉中6種分析物的線性范圍考察

2.4 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計算大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素峰面積的RSD分別為0.79%、0.83%、1.11%、1.31%、0.96%、0.73%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取編號為S12的淡豆豉粉末，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12和24 h按“2.1”項下測定大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的峰面積，結(jié)果RSD分別為1.11%、2.89%、1.63%、0.87%、1.06%、1.25%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批淡豆豉粉末(編號為S12)6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下測定各成分的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的平均含量分別為17.62、27.46、57.07、372.38、129.74、311.18 μg·g-1，RSD分別為1.23%、1.42%、1.78%、1.18%、2.99%、1.16%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.7 回收率試驗 取重復(fù)性試驗同批次淡豆豉粉末約1 g，精密稱定，平行6份，每份分別精密加入近似等量的6種對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下測定各成分的峰面積，計算各個化合物的回收率和回收率的RSD結(jié)果見表3，結(jié)果表明該方法回收率良好。

2.8 耐用性試驗

2.8.1 改變色譜柱 取淡豆豉粉末(編號為S12)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下以不同色譜柱：Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo Betasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算6種分析物的含量，結(jié)果表明本色譜條件在一定色譜柱變動情況下耐用(見表4)。

表3 淡豆豉6個分析物的回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.8.2 改變流動相pH 取淡豆豉粉末(編號為S12)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。在甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.05%、0.10%、0.15%情況下，按“2.1”項下測定6種分析物的含量，結(jié)果表明本色譜條件在一定流動相pH值變動情況下耐用(見表4)。

2.8.3 改變流速 取淡豆豉粉末(編號為S12)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件以不同流速(0.6、0.8、1.0 mL·min-1)進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算6種分析物的含量，結(jié)果表明本色譜條件在一定流速變動情況下耐用(見表4)。

表4 耐用性試驗結(jié)果

2.8.4 改變柱溫 取淡豆豉粉末(編號為S12)，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件以不同柱溫(25、30、35 ℃)進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算6種分析物的含量，結(jié)果表明本色譜條件在一定柱溫變動情況下耐用(見表4)。

2.9 樣品含量測定 取編號為S1～S14的樣品粉末，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定不同編號的粉末，計算各樣品中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的含量，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果(μg·g-1)

注：“-”表示未檢出

3 討論

檢測波長的選擇，通過對6種分析物進(jìn)行DAD全波長掃描，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的最大吸收波長分別為250、258、260、248、257、260 nm，綜合6種黃酮類成分在254 nm處均有良好的紫外吸收。因此，選擇254 nm作為檢測波長。

流動相選擇，分別比較了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)及其不同比例梯度洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫時，黃豆黃苷不能出峰，其他色譜峰重疊，而用甲醇-水梯度洗脫時，6種成分峰形不佳，改用甲醇-0.1%甲酸水溶液洗脫時，6種成分的分離效果明顯改善，且峰形較好，基線穩(wěn)定。故最后采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為色譜流動相。

通過分析方法學(xué)的驗證，本試驗驗證了該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、線性范圍和加樣回收率等均符合分析要求。最后通過對不同來源樣品的含量測定，結(jié)果表明，市場上收集淡豆豉的成品與企業(yè)生產(chǎn)的相比，其黃酮類成分含量普遍偏低，這可能市場上銷售的部分淡豆豉可能省略了再悶過程，從而使產(chǎn)品質(zhì)量較差。且不同來源淡豆豉黃酮類單體成分的含量差別也較大，推測與藥材的生長環(huán)境、炮制加工方法的不同有關(guān)。此外，通過對福建咸康藥業(yè)有限公司收集的原料黑豆和淡豆豉成品研究發(fā)現(xiàn)，淡豆豉中苷元成分的含量顯著增加，糖苷成分明顯減少，提示淡豆豉的炮制存在由苷向苷元轉(zhuǎn)化的過程。說明大豆經(jīng)炮制后，糖苷配基解離，得到游離型的苷元，其生理活性增強(qiáng)，從而使淡豆豉的藥用價值得到充分體現(xiàn)。

根據(jù)耐用性試驗要求，我們針對其進(jìn)行了不同品牌色譜柱、不同流動相pH、不同流速及不同柱溫的考察。結(jié)果表明，不同色譜條件下6種分析物的含量具有良好的重現(xiàn)性，RSD小于1%。色譜條件在一定范圍內(nèi)變化對試驗結(jié)果影響較小，表明方法耐用性良好。

綜上所述，本試驗所建立的高效液相色譜(HPLC)法同時測定淡豆豉中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素含量的方法操作簡便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確且可行，可以為淡豆豉質(zhì)控的提升提供參考，進(jìn)一步為淡豆豉的炮制化學(xué)、炮制發(fā)酵機(jī)制和發(fā)酵產(chǎn)物的活性評價奠定基礎(chǔ)。