■譚敬儀 曹志勇 黃 偉 熊思然 鄭 躍 余開文 陶琳麗，3 楊秀娟，3*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與信息工程學(xué)院，云南昆明650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南昆明650201）

我國是世界上大豆生產(chǎn)量最大的國家之一，大豆的資源非常豐富。其中豆粕蛋白含量一般在40%～50%之間，豆粕在飼料中的應(yīng)用方法主要有：一是作為蛋白原料直接添加，二是酶解豆粕和發(fā)酵豆粕，即利用現(xiàn)代生物技術(shù)將大豆蛋白通過蛋白酶酶解或微生物發(fā)酵降解為可溶性蛋白和小分子多肽的混合物。然而，在20世紀70年代，研究發(fā)現(xiàn)含2個和3個氨基酸的小肽是蛋白質(zhì)水解的主要產(chǎn)物，含2或3個氨基酸殘基的小肽可以通過載體直接被吸收。許多試驗證明，蛋白質(zhì)在降解為氨基酸的過程中產(chǎn)生的中間體小肽可被動物體直接吸收。而蛋白質(zhì)的水解方法有三種，分別是化學(xué)水解法、酶水解法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)水解法分為酸水解法和堿水解法兩種水解方法，其優(yōu)點就是水解的工藝流程簡單、成本低廉、酸和堿容易購買、操作簡單。本試驗以豆粕為原料，探索鹽酸水解方法制備2～3個氨基酸組成的小肽的工藝條件，并通過正交試驗以期獲得最優(yōu)水解工藝條件，為豆粕的深加工利用研制出一種既營養(yǎng)豐富，又安全可靠的小肽產(chǎn)品，為今后豆粕深加工和綜合利用提供科學(xué)的方法和依據(jù)供參考。

1 材料與方法

1.1 豆粕

購至金田園飼料有限公司，進行粉碎后供水解使用。

1.2 試驗儀器

半自動凱氏定氮儀(SKD-1000)，上海沛歐分析儀器有限公司。pH計（pHS-3D），上海精密科學(xué)儀器有限公司；冷凍干燥機FD-1C-50，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3 試劑

中性甲醛溶液（36%）：應(yīng)不含有聚合物，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH值為7.0。

0.1 mol/l硫酸標準滴定溶液。

1.4 方法

試驗采用正交試驗設(shè)計，對水解時間（4、6、8 h）、鹽酸濃度（2、4、6 mol/l）、料液比（1:4、1:5、1:6）三個因素三個水平的正交試驗設(shè)計，共9組，見表1。

表1 正交試驗設(shè)計表L9（33）

式中：氨基態(tài)氮采用甲醛滴定法進行測定；

總氮含量采用凱氏定氮法進行測定。

從理論計算，當水解液中的水解度為30%～50%之間時，可得到豆粕飼料小肽。

1.4.1 樣品制備

取(1.50±0.01) g 豆粕于水解管中，按表1 中添加不同濃度、不同的體積的酸溶液，抽真空后用噴燈將水解管管口封嚴，置于(110±1) ℃烘箱中水解不同的時間。取出水解管，待其冷卻后切開，用定性濾紙過濾至25 ml容量瓶內(nèi)，定容至刻度。

1.4.2 總氨基態(tài)氮的測定

采用甲醛滴定法進行測定，吸取5 ml 水解液，加50 ml水，置于100 ml燒杯中開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準溶液（0.05 mol/l）滴定至酸度計指示pH 值8.2，加入10.0 ml中性甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標準溶液（0.05 mol/l）繼續(xù)滴定至pH值9.2，記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液(0.05 mol/l)的毫升數(shù)。試樣中氨基態(tài)氮的含量按下式進行計算。

式中：X——試樣中氨基態(tài)氮的含量（g/ml）；

V1——測定試樣加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積（ml）；

V2——空白試樣加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積（ml）；

V3——試樣取用量（ml）；

c——氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度（mol/l）；

0.014——與1.00 ml 氫氧化鈉標準滴定溶液(1.00 mol/l)相當?shù)牡馁|(zhì)量(g)。

1.4.3 總氮含量的測定

采用全量凱氏定氮法，吸取5 ml水解液到消化管底部（不要黏在管壁內(nèi)），加入0.4 g 無水硫酸銅、6 g無水硫酸鉀和10 ml 濃硫酸。 將上一步中的消化管放上小漏斗置于通風櫥中電爐上加熱消化，開始溫度為150 ℃30 min，后調(diào)為250 ℃30 min，350 ℃1 h，380 ℃1 h，當消化液變?yōu)楹稚珪r將消化管取下冷卻，消化到顏色由淡黃色變成透明的藍綠色并無黑色雜質(zhì)時。停止消化，待消化管在消化爐中冷卻到室溫時，取下消化管并加入少量的蒸餾水。接著用全自動凱氏定氮儀進行蒸餾，在蒸餾結(jié)束后的硼酸吸收液中滴加1～2 滴甲基紅-溴甲酚綠指示劑，用0.1 mol/l 的硫酸標準液滴定，當溶液由藍綠色變?yōu)榛壹t色為滴定終點，并記下滴定終點時鹽酸標準溶液的使用量。

原料中的總氮含量計算公式如下：

式中：X——試樣中總氮含量（g/ml）；

V1——滴定試樣時所消耗的硫酸體積(ml）；

V2——滴定空白試樣時所消耗的硫酸體積(ml）;

V3——試樣取用量(ml）；

c——硫酸標準滴定溶液的濃度（mol/l）；

0.014——與1.00 ml硫酸標準滴定溶液(1.00 mol/l)相當?shù)牡馁|(zhì)量（g）。

每個容量瓶做2個平行測定，以其算數(shù)平均值為結(jié)果。

1.4.4 平均肽鏈長度（APL）測定

需要測定α-氨基氮含量和總氮（T）含量。用甲醛滴定法測定α-NH2-N 含量，總氮用凱氏定氮法測定。然后計算平均肽鏈長度，公式如下：

平均肽鏈長度(APL)=總氮含量/α-氨基氮含量

1.4.5 肽分子平均相對分子質(zhì)量（PMW）

肽分子平均相對分子質(zhì)量(PMW)計算公式：

PMW=肽分子平均鏈長（PCL）×氨基酸平均相對分子質(zhì)量(氨基酸平均相對分子質(zhì)量為120)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水解條件對豆粕水解度的影響

按照1.4 方法中的正交試驗設(shè)計，對豆粕進行水解，分別測定水解液中的氨基態(tài)氮、總氮，結(jié)果見表2。

表2 不同水解工藝水解結(jié)果比較分析

從表2中可以看出，水解條件對各處理組間的氮水解回收率、氨基態(tài)氮、總氮和水解度影響存在一定的差異，從氮水解回收率看，處理1與其余8個處理間差異顯著（P＜0.05），處理2、4與處理7間差異不顯著（P＞0.05），處理3、4、5、6、7、8 與處理9 間差異不顯著（P＞0.05）；而氨基態(tài)氮結(jié)果中，處理1、2、3、8分別與其余各處理間差異顯著（P＜0.05），處理4與處理7間，處理5、6與處理9間差異不顯著（P＞0.05）；從總氮中可以看出，處理1、5與其余各組間差異顯著（P＜0.05），處理2、3、4、6、7、8 和處理9 間差異不顯著（P＞0.05）；從水解度看，處理1、6、9與其余各處理間差異顯著（P＜0.05），處理2與處理5間差異不顯著（P＞0.05），與其余各處理差異顯著（P＜0.05），處理3、7、8間差異不顯著（P＞0.05），處理4、7、8間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同水解條件對豆粕小肽平均肽鏈長度和小肽平均分子量的影響（見表3）

從表3可以看出，水解條件對各處理間平均肽鏈長度（APL）、肽分子平均相對分子質(zhì)量（PMW）有差異，并且都呈現(xiàn)了相同的趨勢，處理1、2、5與其余各處理間APL、PMW均差異顯著（P＜0.05）；處理3、7與處理8間差異不顯著（P＞0.05），與其余各處理間差異顯著（P＜0.05）；處理4、7與處理8間不顯著（P＞0.05），與其余各處理間差異顯著（P＜0.05）；處理6、9間差異不顯著（P＞0.05），與其余各處理間差異顯著（P＜0.05）。

表3 豆粕小肽平均肽鏈長度和小肽平均分子量比較分析

小肽是指由2～3 個氨基酸組成的寡肽，從表3 可以看出，處理1、2、5 的平均肽鏈長度（APL）在2～3 個氨基酸殘基之間，滿足豆粕小肽所需的肽鏈長度，其余6 個處理均小于2 個氨基酸殘基，不滿足豆粕小肽所需的肽鏈長度，但是處理5的氮水解回收率顯著高于處理1和處理2（P＜0.05），所以處理5的水解工藝條件要優(yōu)于處理1和處理2，即當鹽酸濃度為3 mol/l，料液比為1:5，水解5 h 的水解工藝條件下，此時平均鏈長為2.14 個氨基酸殘基，能達到小肽要求的平均肽鏈長度，即豆粕水解為小肽。

2.3 不同工藝條件對各指標影響的主效應(yīng)分析

為了比較不同水解條件對氨基態(tài)氮含量、總氮含量、水解度、氮水解回收率、平均肽鏈長度、肽平均分子量等因素的影響的主次順序，采用極差方法，以極差值大小確定各因素的影響主次順序，結(jié)果見表4。

從表4中可以看出，水解時間、鹽酸濃度、料液比三個水解條件對水解度、平均肽鏈長度、肽平均分子量、總氮四個指標的影響主效應(yīng)是一樣的，即鹽酸濃度＞水解時間＞料液比；水解時間、鹽酸濃度、料液比三個水解條件對氨基態(tài)氮指標的影響主效應(yīng)即為料液比＞水解時間＞鹽酸濃度；水解時間、鹽酸濃度、料液比三個水解條件對氮回收率指標的影響主效應(yīng)即為水解時間＞鹽酸濃度＞料液比。極差越大說明該因素的影響也就越大。

3 討論

本試驗研究中所設(shè)計的水解時間、鹽酸濃度和料液比三個水解條件中，三個條件都是影響試驗指標的重要因素，其中鹽酸濃度是影響試驗指標的主要因素。陳曉剛等（2011）采用響應(yīng)面分析法對酸水解制備波紋巴非蛤小分子肽工藝進行優(yōu)化，得到的最優(yōu)酸水解條件為：固液質(zhì)量比1:3、鹽酸濃度6.4 mol/l、酸水解溫度92 ℃、酸水解時間5.3 h，在此條件下肽得率為82.21%，與鹽酸濃度固定為6 mol/l 的條件下，隨著酸水解溫度的升高，肽得率呈先上升后下降的趨勢，主要是因為溫度過高，小分子肽開始大量地進一步分解為游離氨基酸，導(dǎo)致肽得率下降。在最優(yōu)工藝條件下，肽得率可達到82.21%。喬偉等（2006）酸水解制備飼料小肽的初步研究中提出本試驗結(jié)果表明：溫度和時間對酸水解程度有較大影響，其中溫度的影響更大。適合的水解條件為反應(yīng)溫度90 ℃。反應(yīng)時間5 h，終產(chǎn)物二肽、三肽含量為19.38%。喬偉等（2006）著重從酸解中的溫度因素分析蛋白質(zhì)水解程度。本試驗結(jié)果表明的最優(yōu)豆粕蛋白水解條件為水解時間為4 h、鹽酸濃度為3 mol/l、料液比為1:4。試驗結(jié)果表明的最優(yōu)豆粕蛋白水解條件為水解時間為5 h、鹽酸濃度為3 mol/l、料液比為1:5，造成差異的原因可能是本試驗采用的時間與鹽酸濃度不同造成試驗結(jié)果有所差異。

表4 影響各指標的主效應(yīng)分析

4 結(jié)論

水解時間、鹽酸濃度、料液比三個水解條件都是影響游離態(tài)氮、總氮和氨基態(tài)氮、水解度的主要因素，其中鹽酸濃度是影響試驗指標的主要因素。經(jīng)過試驗得到的結(jié)論如下：水解豆粕的最優(yōu)水解工藝條件為當豆粕水解小肽水解時間為5 h、鹽酸濃度為3 mol/l、料液比為1:5時水解度在30%～50%，達到試驗?zāi)康?～3個氨基酸殘基的大豆小肽，氮回收率達到79.59%。