■王 穎 李雅華 咸洪泉

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室，山東青島266109）

刺參“腐皮綜合征”是一種重要的刺參病害[1-2]。該病具有發(fā)病急、發(fā)病率高和死亡率高的特點(diǎn)。幼參和成參均可被感染，其中幼參的發(fā)病率和死亡率均明顯高于成參，死亡率高達(dá)90%以上[3]。將“腐皮綜合征”拮抗菌制成微生態(tài)制劑應(yīng)用是一種有效的刺參“腐皮綜合征”防控手段。而微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)必須首先解決拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)的問(wèn)題，因?yàn)椴煌霓卓咕N所適宜的培養(yǎng)發(fā)酵條件不同，因此研究?jī)?yōu)化“腐皮綜合征”拮抗菌高效發(fā)酵條件，對(duì)刺參“腐皮綜合征”病害的防控具有重要意義，可為拮抗菌微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)和微生物發(fā)酵飼料的研制奠定基礎(chǔ)，為將來(lái)拮抗菌微生態(tài)制劑和微生物發(fā)酵飼料的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

刺參“腐皮綜合征”是由海水中的燦爛弧菌、假交替單胞菌等病原菌侵入、感染引起的一種刺參重要病害[4]。目前用于防治刺參病害的方法主要有使用抗生素[5]、免疫增強(qiáng)劑[6]、微生態(tài)制劑[7]等?？股氐氖褂貌粌H造成了環(huán)境的污染，也使細(xì)菌產(chǎn)生了抗性，為控制抗性細(xì)菌需進(jìn)一步增加抗生素的投放量[8]，形成了惡性循環(huán)。免疫增強(qiáng)劑是通過(guò)添加一些多糖[9]（如殼聚糖、海藻硫酸多糖等）或植物源物質(zhì)(如黨參[10]、甘草酸[11]等)對(duì)刺參腸道組織消化酶、蛋白酶等的影響，增強(qiáng)刺參自身的免疫力，從而達(dá)到防病的目的。微生態(tài)制劑是可直接使用的活菌制劑，制劑中的有益微生物不但可以改善水質(zhì)，可能還含有其它活性物質(zhì)，能夠幫助刺參的傷口愈合，并能夠抑制致病的病原菌感染，具有防治病害發(fā)生的作用[12]。有益微生物的使用是刺參“腐皮綜合征”病害防控的重要措施和發(fā)展趨勢(shì)。

拮抗菌CN101 是本實(shí)驗(yàn)室篩選的對(duì)病原菌燦爛弧菌和假交替單胞菌有強(qiáng)拮抗作用、應(yīng)用安全的一株芽孢桿菌[13]，對(duì)刺參“腐皮綜合征”有良好的防治效果，可用于微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)和微生物發(fā)酵飼料的研制，以防治刺參“腐皮綜合征”病害。而將該菌株用于制備微生物飼料添加劑的基礎(chǔ)和關(guān)鍵是明確拮抗菌CN101的最適發(fā)酵條件，以便于實(shí)現(xiàn)拮抗菌CN101的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。因此，本研究在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)拮抗菌CN101 的生產(chǎn)發(fā)酵條件進(jìn)行探究，為防控刺參“腐皮綜合征”病害和微生物飼料添加劑的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

拮抗菌CN101（Bacillus.sp），分離自刺參養(yǎng)殖池底泥，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 ml，pH值7.0。

BS 培養(yǎng)基：參考張璐等的發(fā)酵培養(yǎng)基[14]，乳糖20 g、牛肉膏15 g、K2HPO3·3H2O 0.75 g、MgSO40.75 g、蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

Luo 培養(yǎng)基：參考駱?biāo)囄牡膬?yōu)化培養(yǎng)基[7]，葡萄糖10 g、豆餅粉10 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 ml，pH 值7.5。

2116 培養(yǎng)基：酵母粉1 g、蛋白胨5 g、人工海水1 000 ml，pH值7.5。

人工海水配方：NaCl 28.15 g、MgSO4·7H2O 6.92 g、MgCl2·6H2O 5.51 g、CaCl2·7H2O 0.3 g、KCl 0.67 g、蒸餾水定容至1 000 ml。

li 培 養(yǎng) 基：MgSO4·7H2O 0.2 g、NaH2PO41 g、Na2HPO41 g、葡萄糖10 g、NaCl 5 g、MnSO40.48 g、豆餅粉2 g、玉米粉2 g、蒸餾水1 000 ml，pH值7.0。

1.3 種子液的制備

拮抗菌CN101平板劃線至LB固體培養(yǎng)基，挑單菌落接種至100 ml LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、140 r/min搖床培養(yǎng)24 h，備用。

1.4 細(xì)菌數(shù)量測(cè)定方法

拮抗菌細(xì)菌數(shù)量以O(shè)D600值的大小表示，利用752型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)采用比濁法進(jìn)行測(cè)定。以滅菌的相應(yīng)培養(yǎng)基調(diào)零，將培養(yǎng)一定時(shí)間的發(fā)酵液樣品用滅菌的相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋至OD600值的大小在0.2～0.8 之間，測(cè)定稀釋樣品的OD600值。細(xì)菌生物量=稀釋樣品的OD600值×樣品的稀釋倍數(shù)。

1.5 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.5.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

將種子液以1%的比例接種到裝有100 ml不同培養(yǎng)基的250 ml 三角瓶中，28 ℃、140 r/min 培養(yǎng)，每24 h取樣測(cè)定OD600值一次，測(cè)至72 h，三次重復(fù)。

1.5.2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

碳源優(yōu)化，分別用蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉等量替換乳糖作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源，其它組分不變，測(cè)定不同碳源對(duì)拮抗菌數(shù)量的影響。

氮源優(yōu)化，分別用豆餅粉、蛋白胨、（NH4）2SO4、KNO3、NH4NO3作為氮源等量替換牛肉膏，其它組分不變，測(cè)定不同氮源對(duì)拮抗菌數(shù)量的影響。

無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化，分別用A組MgSO4+MnSO4+K2HPO4、B 組MgSO4+MnSO4+NaCl、C 組K2HPO4+MnSO4+NaCl、D 組K2HPO4+MgSO4、E 組K2HPO4+MgSO4+ NaCl、F 組K2HPO4+MnSO4組合作為無(wú)機(jī)鹽（總量均為1.5 g/l，各組分之間的比例為1:1），其它組分不變，測(cè)定不同無(wú)機(jī)鹽組合對(duì)拮抗菌數(shù)量的影響。

正交試驗(yàn)：用Spss 20進(jìn)行三因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1），確定一組最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

1.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

溫度對(duì)發(fā)酵的影響，將種子液接種到裝有100 ml培養(yǎng)基的250 ml 三角瓶中，分別置于15、20、25、30、35 ℃全溫振蕩培養(yǎng)箱中，140 r/min 振蕩培養(yǎng)，每24 h測(cè)定一次細(xì)菌數(shù)量，測(cè)至72 h；三次重復(fù)。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(g/l)

初始pH 值對(duì)發(fā)酵的影響，分別調(diào)節(jié)優(yōu)化培養(yǎng)基的初始pH值為6、7、7.5、8、9，在25 ℃、140 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，檢測(cè)不同pH值和培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)菌數(shù)量；三次重復(fù)。

接種量對(duì)發(fā)酵的影響，分別按照1%、3%、5%、7%、9%的接種量，將種子液接種到裝有100 ml 優(yōu)化培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，在25 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，檢測(cè)不同接種量和培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)菌數(shù)量；三次重復(fù)。

裝瓶量對(duì)發(fā)酵的影響，250 ml三角瓶中分別裝入25、50、75、100、125 ml的優(yōu)化培養(yǎng)基，以1%的接種量接種種子液，在25 ℃、140 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，檢測(cè)不同裝瓶量和培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)菌數(shù)量；三次重復(fù)。

1.7 分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism7.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。方差分析采用顯著水平為P＜0.05 的多重比較檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基成分優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，選取5種較適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選，檢測(cè)了不同培養(yǎng)基中拮抗菌CN101的生長(zhǎng)情況（圖1）。

圖1 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

結(jié)果顯示，24 h時(shí)BS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果均較好，且兩者之間無(wú)顯著差異；48 h和72 h時(shí)，BS培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于LB培養(yǎng)基，說(shuō)明BS培養(yǎng)基更適于拮抗菌的培養(yǎng)。因此，本試驗(yàn)以BS 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件的優(yōu)化。

2.1.2 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

以BS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測(cè)定了淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、玉米粉5 種碳源對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響（圖2）。不同碳源對(duì)拮抗菌的生長(zhǎng)有不同程度的影響，供試的碳源中乳糖、蔗糖、葡萄糖較有利于拮抗菌的生長(zhǎng)，而淀粉和玉米粉不利于拮抗菌的生長(zhǎng)；24 h時(shí)培養(yǎng)基中添加蔗糖的菌體數(shù)量顯著高于添加乳糖、葡萄糖；48 h 和72 h 時(shí)，培養(yǎng)基中添加乳糖的菌體數(shù)量顯著高于添加其他碳源的。培養(yǎng)基中菌體數(shù)量在24 h和48 h時(shí)蔗糖顯著高于葡萄糖，72 h時(shí)差異不顯著；說(shuō)明以蔗糖為碳源有利于拮抗菌的快速生長(zhǎng)繁殖，以乳糖為碳源有利于獲得更高的拮抗菌數(shù)量。

圖2 不同碳源發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

因此，綜合考慮生長(zhǎng)速率、生物產(chǎn)量和原料成本的問(wèn)題，進(jìn)一步檢測(cè)了乳糖和蔗糖的不同配比對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響（圖3）。結(jié)果表明以乳糖和蔗糖為復(fù)合碳源時(shí)乳糖與蔗糖比例為3:1時(shí)，拮抗菌生長(zhǎng)速率、生物產(chǎn)量與以乳糖為單一碳源時(shí)無(wú)顯著性差異，但有利于降低拮抗菌發(fā)酵生產(chǎn)的原料成本。所以拮抗菌發(fā)酵適宜的碳源為乳糖和蔗糖組成的復(fù)合碳源，乳糖與蔗糖的比例為3:1。

以乳糖和蔗糖復(fù)合碳源作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源，測(cè)定了不同氮源對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明不同氮源對(duì)拮抗菌的生長(zhǎng)有一定影響（圖4）。有機(jī)氮源有利于拮抗菌的生長(zhǎng)；其中在24 h和48 h時(shí)，含有機(jī)氮源豆餅粉的發(fā)酵培養(yǎng)基的拮抗菌菌體量最高，與其他氮源相比差異顯著。72 h 時(shí)蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基拮抗菌菌體量最高，并且顯著高于豆餅粉。為獲得較高的產(chǎn)量和降低成本，進(jìn)一步檢測(cè)了不同配比蛋白胨和豆餅粉對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示當(dāng)復(fù)合氮源蛋白胨與豆餅粉比例為1:2 時(shí)，更適宜拮抗菌的生長(zhǎng)（圖5）。

圖3 不同碳源比例發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖4 不同氮源發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖5 不同氮源比例發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

以優(yōu)選的復(fù)合碳源、復(fù)合氮源作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源和氮源，探討了不同無(wú)機(jī)鹽組合對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響（見(jiàn)圖6）。圖6結(jié)果顯示24 h和48 h均以B組無(wú)機(jī)鹽組合MgSO4+MnSO4+ NaCl組合的菌體量最大、培養(yǎng)效果最好，故選擇了B組合為最佳的無(wú)機(jī)鹽組合。

圖6 不同無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基中復(fù)合碳源、復(fù)合氮源和復(fù)合無(wú)機(jī)鹽含量對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，復(fù)合氮源含量為影響CN101 生長(zhǎng)的主要因素，復(fù)合碳源含量為次要因素，復(fù)合無(wú)機(jī)鹽含量對(duì)CN101的生長(zhǎng)影響最小。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化獲得的較優(yōu)培養(yǎng)基配方(A組)與正交試驗(yàn)獲得的培養(yǎng)基較優(yōu)培養(yǎng)基配方(B組)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其無(wú)機(jī)鹽水平不同，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示：24 h和48 h時(shí)兩處理組間差異均不顯著，即較高水平的無(wú)機(jī)鹽含量對(duì)拮抗菌的生物量影響較?。辉摻Y(jié)果也同時(shí)驗(yàn)證了本研究正交試驗(yàn)中獲得的培養(yǎng)基成分對(duì)拮抗菌生物量的影響作用的結(jié)果：復(fù)合氮源為主要影響因子，復(fù)合碳源次之，復(fù)合無(wú)機(jī)鹽的影響最小。

因此，考慮到節(jié)約生產(chǎn)成本，本試驗(yàn)最終確定的培養(yǎng)基配方為：乳糖15 g、蔗糖5 g、蛋白胨2.5 g、豆餅粉5 g、MgSO40.25 g、MnSO40.25 g、NaCl 0.25 g、蒸餾水1 000 ml。

圖7 CN101正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

溫度試驗(yàn)結(jié)果（圖8）表明，拮抗菌在15～35 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，以25 ℃生長(zhǎng)最快，其次是20 ℃。因此，拮抗菌的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃。

圖8 不同發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

拮抗菌在pH值6～9范圍內(nèi)生長(zhǎng)狀況良好（圖9），雖然不同初始pH值條件下拮抗菌數(shù)量差異達(dá)到顯著水平，但不同pH 值處理的OD 值差異并不大；綜合考慮拮抗菌將來(lái)應(yīng)用的環(huán)境條件和馴化因素，為使拮抗菌更好的適應(yīng)海參生長(zhǎng)環(huán)境，發(fā)揮生長(zhǎng)潛能，初始pH值以7.5為最佳。

不同的接種量對(duì)拮抗菌培養(yǎng)具有一定的影響（圖10），雖然培養(yǎng)至48 h和72 h時(shí)不同接種量處理的拮抗菌數(shù)量差異達(dá)到顯著水平，但不同接種量處理的OD 值差異并不大，因此為節(jié)約生產(chǎn)成本，以1%的接種量為宜。

不同的裝瓶量對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響極大（圖11），裝瓶量越高越不利于拮抗菌的生長(zhǎng)繁殖，說(shuō)明該菌株是一株好氧菌，培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)充分保障氧氣的供給量，搖瓶振蕩培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基的裝液量應(yīng)以10%～20%為宜。

圖9 不同初始pH值發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖10 不同接種量發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖11 不同裝瓶量發(fā)酵對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

綜上所述，本試驗(yàn)最終確定的發(fā)酵條件為接種量1%、裝瓶量10%～20%、溫度25 ℃、培養(yǎng)基初始pH 值為7.5。

將發(fā)酵條件優(yōu)化前（OD600約為5）、優(yōu)化后（OD600約為20～30）的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，拮抗菌CN101 的菌體量提高了約4～6倍。

3 討論

目前微生物飼料在禽類和反芻類動(dòng)物飼料中應(yīng)用較廣泛，效果顯著[15]，以拮抗菌、益生菌等有益微生物開(kāi)發(fā)的微生物飼料添加劑應(yīng)用于刺參養(yǎng)殖呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

益生菌促進(jìn)刺參生長(zhǎng)、提高刺參抗病性一般是通過(guò)抑制病原菌、調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境、增強(qiáng)消化酶、蛋白酶、淀粉酶活性等改善健康狀況、刺激胃部發(fā)育和促進(jìn)酶分泌等機(jī)制發(fā)揮作用[16-17]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于刺參養(yǎng)殖的拮抗菌研究，主要包括微生物發(fā)酵飼料[18]、免疫增強(qiáng)劑[6]、微生態(tài)制劑[7]等，大多數(shù)拮抗菌來(lái)源于刺參腸道內(nèi)部或海洋細(xì)菌，這些拮抗菌對(duì)海水環(huán)境具有良好的適應(yīng)性。

本研究通過(guò)單因素控制變量法和正交試驗(yàn)，對(duì)分離自刺參養(yǎng)殖池底泥的拮抗菌株CN101 的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的培養(yǎng)基配方為乳糖15 g、蔗糖5 g、蛋白胨2.5 g、豆餅粉5 g、MgSO40.25 g、MnSO40.25 g、NaCl 0.25 g。這與張璐等[14]、董春光[19]的研究不一致，可能是不同菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)要素、營(yíng)養(yǎng)水平的需求不同所致。同時(shí)，本研究結(jié)果表明無(wú)機(jī)氮源不利于CN101菌株的生長(zhǎng)，這與曹雪梅等[20]研究的海洋細(xì)菌GM-1-1菌株相似。拮抗菌CN101在20～30 ℃、pH值7～9范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，而海參生長(zhǎng)的最適pH值在7.5～8.5 之間、適宜溫度范圍為15～23 ℃[21]，說(shuō)明海參生長(zhǎng)的溫度、pH 值環(huán)境也是拮抗菌CN101 較適宜生長(zhǎng)的條件，且拮抗菌CN101適宜生長(zhǎng)的溫度、pH值環(huán)境條件范圍更寬；拮抗菌能夠在海參養(yǎng)殖環(huán)境中較好的生長(zhǎng)繁殖，這有利于拮抗菌發(fā)揮其生防潛能。不同細(xì)菌菌株適宜的發(fā)酵條件不同[22-23]，研究不同有益細(xì)菌的最佳發(fā)酵條件是開(kāi)發(fā)相應(yīng)細(xì)菌菌劑的基礎(chǔ)。拮抗菌CN101 的最佳發(fā)酵條件為接種量1%、裝瓶量10%～20%、溫度25 ℃、初始pH值為7.5，該研究結(jié)果為拮抗菌CN101發(fā)酵培養(yǎng)提供了科學(xué)依據(jù)，也為利用CN101菌株研發(fā)微生物飼料添加劑奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

①拮抗菌CN101的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為乳糖15 g、蔗糖5 g、蛋白胨5 g、豆餅粉10 g、MgSO40.25 g、MnSO40.25 g、NaCl 0.25 g、蒸餾水1 000 ml。

②拮抗菌CN101的最佳發(fā)酵條件為接種量1%、裝瓶量10%～20%、溫度25 ℃、初始pH值為7.5。