■張秀江 胡 虹* 王秋菊 權(quán)淑靜 馮 菲 谷立峰 卓 輝

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司,河南鄭州450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450008）

我國在養(yǎng)殖業(yè)中規(guī)定允許使用的飼用抗生素的種類越來越少，禁用飼用抗生素已是大勢(shì)所趨。研發(fā)飼用抗生素的替代品成為動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。發(fā)酵飼料作為一類新型、綠色、環(huán)保的飼料,由于其在生產(chǎn)過程中微生物發(fā)酵可以產(chǎn)生大量有益于動(dòng)物健康的代謝產(chǎn)物,可在一定程度上減少養(yǎng)殖過程中飼用抗生素的使用，從而降低養(yǎng)殖成本。因此,發(fā)酵飼料的研發(fā)與推廣應(yīng)用備受關(guān)注[1]。在動(dòng)物生產(chǎn)中使用發(fā)酵飼料可維持動(dòng)物消化道微生態(tài)平衡[2],增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫力、提高生長性能[3-4]。

乳酸菌是應(yīng)用發(fā)酵飼料最早、最廣泛的一類益生菌，通常為異養(yǎng)厭氧菌[5]。乳酸菌具有一些特殊的生物學(xué)功能，發(fā)酵飼料過程可產(chǎn)生有機(jī)酸、多糖、生長因子、維生素等，顯著提高飼料消化率和生物效價(jià)。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶類把結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量較大的蛋白質(zhì)降解為小分子肽和游離氨基酸，利于胃腸消化吸收[6]。乳酸菌在發(fā)酵飼料過程中可以產(chǎn)生大量的乳酸和揮發(fā)酸（如乙酸等）等酸性物質(zhì),使飼料酸度增強(qiáng),抑制或殺滅沙門氏菌和大腸桿菌[7]。當(dāng)前我國關(guān)于發(fā)酵飼料在養(yǎng)豬方面的研究和應(yīng)用主要集中于發(fā)酵飼料對(duì)豬生長性能等指標(biāo)的影響，而且多在仔豬階段。有關(guān)發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬養(yǎng)分表觀消化率、糞樣菌群、血液生化指標(biāo)和生產(chǎn)性能的影響的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)以選育的乳酸菌制作液體發(fā)酵飼料，探討液體發(fā)酵飼料替代日糧部分全價(jià)飼料對(duì)育肥豬養(yǎng)分表觀消化率、糞樣菌群、血液生化指標(biāo)和生產(chǎn)性能的影響，為發(fā)酵飼料在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇200頭體重60 kg左右的“杜×長×大”三元雜交豬，按照體重相近、公母各半的原則隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭豬。對(duì)照組（Ⅰ組）飼喂基礎(chǔ)日糧，三個(gè)試驗(yàn)組分別飼喂添加10%（Ⅱ組）、30%(Ⅲ組)、50%（Ⅳ組）的乳酸菌液體發(fā)酵飼料替代基礎(chǔ)日糧中相應(yīng)比例的全價(jià)配合飼料。試驗(yàn)豬群采用群飼，每舍飼養(yǎng)10 頭（1 個(gè)重復(fù)），自由采食和采用鴨舌式自動(dòng)飲水器飲水，飼養(yǎng)管理按常規(guī)進(jìn)行，試驗(yàn)前對(duì)豬舍進(jìn)行消毒。試驗(yàn)于2019年4月20日至6 月5 日在羅山縣鑫隆家庭農(nóng)場養(yǎng)豬場進(jìn)行，預(yù)試期7 d，試驗(yàn)期40 d。

1.2 基礎(chǔ)日糧

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 發(fā)酵飼料

1.3.1 菌種

液體發(fā)酵飼料菌種為植物乳桿菌（lactobacillus plantarum）UR-3，由河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司采用微生物菌種選育技術(shù)篩選而來，保存于河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心。

1.3.2 乳酸菌液體發(fā)酵飼料

乳酸菌液體發(fā)酵飼料由河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司提供?？紤]到本次發(fā)酵飼料僅供試驗(yàn)和養(yǎng)殖場自用，所以采用20 kg 桶裝式液體發(fā)酵。發(fā)酵桶裝排氣閥，密封完好不漏氣,保質(zhì)期可達(dá)一個(gè)月。將基礎(chǔ)日糧中的玉米、豆粕和麩皮與水按1:3的比例加入發(fā)酵桶中，每桶總質(zhì)量20 kg，接入河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司液體發(fā)酵培養(yǎng)的植物乳桿菌UR-3 種子液1 200 ml，在自然溫度條件下發(fā)酵48～72 h，飼喂前按每桶基礎(chǔ)日糧配方干物質(zhì)的量添加鈣粉、磷酸氫鈣、食鹽、賴氨酸和1%的中大豬預(yù)混料，制成乳酸菌液體發(fā)酵飼料，再分別與90%、70%、50%的基礎(chǔ)日糧相混合，配成試驗(yàn)組（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組）的飼喂日糧。

1.4 飼料養(yǎng)分表觀消化率

每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1頭豬分別于試驗(yàn)10、20、30、40 d采集糞樣500 g，加10%鹽酸進(jìn)行固氮，所采集的糞樣在60 ℃條件下烘干至恒重，粉碎過60 目分樣篩冷藏備用。本試驗(yàn)采用酸不溶灰分（AIA）法[8]測定飼料養(yǎng)分表觀消化率，參照美國AOAC(2000)[9]的分析方法測定飼料和糞便中的養(yǎng)分含量。營養(yǎng)成分表觀消化率的計(jì)算參照Stein等（2001）[10]所采用的方法，試驗(yàn)不同時(shí)間的營養(yǎng)成分表觀消化率分別計(jì)算，取其平均數(shù)，計(jì)算公式為：

D(%)=(1-FIA/EIA)×100

式中：D——營養(yǎng)成分表觀消化率；

FIA——飼料中酸不溶灰分含量；

EIA——糞樣中酸不溶灰分含量。

實(shí)際操作按下述公式進(jìn)行：

飼料中營養(yǎng)成分表觀消化率（%）=[1-飼料中指示劑含量（%）/糞樣中指示劑含量（%）×糞樣中營養(yǎng)成分含量（%）/飼料中營養(yǎng)成分含量（%）]×100

1.5 糞樣菌群

1.5.1 樣品采集

試驗(yàn)第20 d和40 d早上，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇2頭健康豬進(jìn)行糞樣收集，用50 ml 滅菌管管采集新鮮無污染糞樣，放入-20 ℃冰箱保存待測。

1.5.2 糞樣的稀釋

無菌條件下取1 g 糞樣于無菌試管內(nèi)，加入磷酸鹽緩沖液9 ml，用磁力振蕩器振蕩5 min，此液為10-1稀釋液，吸取1 ml此液于盛有9 ml無菌磷酸鹽緩沖液試管中進(jìn)行10-2稀釋，振蕩5 min，依次進(jìn)行10-3～10-6倍稀釋。

1.5.3 培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)

大腸桿菌：取糞樣10-6稀釋液10 μl 接種于伊紅美藍(lán)(EMB)瓊脂培養(yǎng)基平皿上，設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃有氧條件下培養(yǎng)24 h，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定后分別進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，取其平均數(shù)。

乳酸菌：取糞樣10-6稀釋液10 μl 接種于乳酸細(xì)菌(MRS)培養(yǎng)基平皿上，設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h后分別進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，取其平均數(shù)。

沙門氏菌：糞樣10-3稀釋液10 μl 接種于沙門志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS瓊脂培養(yǎng)基）的平皿上，設(shè)3個(gè)重復(fù)，37 ℃有氧條件下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，取其平均數(shù)。

1.6 血液生化指標(biāo)

1.6.1 血清的制備

試驗(yàn)結(jié)束的前一天，將試驗(yàn)豬禁飼12 h，禁飼期間自由飲水。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1 頭豬，頸靜脈采血，室溫放置15 min 后4 000 r/min 離心5 min 分離血清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 血液生化免疫指標(biāo)的測定

血清樣品解凍后，取200 μl用CX4型全自動(dòng)血液生化分析儀（美國Beckman 公司）測定血清中總膽固醇、三酰甘油、總蛋白、白蛋白、尿素氮、葡萄糖，血清免疫球蛋白A、免疫球蛋白G和免疫球蛋白M采用免疫透射比濁法測定。

1.7 生長性能

試驗(yàn)期的第0 d和第40 d的早上，試驗(yàn)豬空腹稱重，記錄體重?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算育肥豬在試驗(yàn)期間的平均日增重。試驗(yàn)期間每天記錄每個(gè)豬圈的飼料總的采食量，計(jì)算育肥豬試驗(yàn)期間的平均日采食量，按平均日采食量和平均日增重計(jì)算料肉比。試驗(yàn)期間密切觀察豬的采食情況、糞便質(zhì)量、記錄發(fā)病及死亡數(shù)量。

發(fā)病率(%)=總發(fā)病頭次數(shù)/(總頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))×100

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用dps 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬養(yǎng)分表觀消化率的影響（見表2）

表2 乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬養(yǎng)分表觀消化率的影響（%）

從表2 可以看出，與對(duì)照組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組養(yǎng)分表觀消化率：粗蛋白質(zhì)分別提高2.90%、8.53%和11.39%(P＜0.05)，粗脂肪分別提高3.45%、10.33%和12.19%(P＜0.05)，粗纖維分別提高20.02%、20.95%和23.26%(P＜0.05)，鈣 分 別 提 高14.07%、20.52%和23.02%(P＜0.05)，總磷分別提高21.67%、28.63%和35.31%(P＜0.05)，氮分別提高4.36%、9.00%和10.45%(P＜0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組粗蛋白質(zhì)、鈣、總磷養(yǎng)分表觀消化率差異顯著(P＜0.05)，粗纖維養(yǎng)分表觀消化率差異不顯著(P＞0.05)。粗脂肪、氮的養(yǎng)分表觀消化率Ⅱ組與Ⅲ、Ⅳ組差異顯著(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬糞樣菌群的影響（見表3）

表3 乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬糞樣菌群的影響（log10 CFU/g）

表3 表明，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組相比，鮮糞中大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量顯著降低(P＜0.05)，乳酸菌的數(shù)量顯著提高(P＜0.05)，差異顯著。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組大腸桿菌數(shù)量的減少與乳酸菌數(shù)量的增加差異顯著(P＜0.05)。沙門氏菌數(shù)量的減少Ⅱ、Ⅲ組和Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著(P＞0.05)，Ⅱ組與Ⅳ組差異顯著(P＜0.05)。

2.3 乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬血液生化指標(biāo)的影響（見表4）

表4 乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬血液生化指標(biāo)的影響

由表4可知，試驗(yàn)四個(gè)組之間三酰甘油和免疫球蛋白M 差異不顯著(P＞0.05)。總膽固醇有降低的趨勢(shì)，對(duì)照組與Ⅱ、Ⅲ組差異不顯著(P＞0.05)，與Ⅳ組差異顯著(P＜0.05)。尿素氮Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組相比明顯降低，差異顯著(P＜0.05)，Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著(P＞0.05)。葡萄糖Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組相比明顯升高，差異顯著(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著(P＞0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的總蛋白、白蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G與對(duì)照組相比升高明顯，差異顯著(P＜0.05)，其中：總蛋白和免疫球蛋白G Ⅱ組與Ⅲ、Ⅳ組差異顯著(P＜0.05)，Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著(P＞0.05)；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組白蛋白差異不顯著(P＞0.05)；免疫球蛋白A Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組差異顯著(P＜0.05)。

2.4 乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬生產(chǎn)性能的影響（見表5）

由表5 可知，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組與對(duì)照組相比，末重和平均日增重明顯增加，分別增加4.34%、4.26%、5.20%和11.88%、12.87%、13.75%，差異顯著(P＜0.05)。末重Ⅱ、Ⅲ組與Ⅳ組差異顯著(P＜0.05)，Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著(P＞0.05)。平均日增重Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組差異不顯著(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組平均日采食量分別增加2.20%、3.53%、4.86%，差異顯著(P＜0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組料肉比與對(duì)照組相比都有不同程度的降低，但僅Ⅱ組降低了8.64%，差異顯著(P＜0.05)。

試驗(yàn)期間全部試驗(yàn)豬無死亡，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的發(fā)病率較對(duì)照組分別降低34.56%、36.34、37.43%，差異顯著(P＜0.05)，Ⅱ組與Ⅳ組之間差異顯著(P＜0.05)，Ⅱ組與Ⅲ組、Ⅲ組與Ⅳ組差異不顯著(P＞0.05)。

表5 乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬生產(chǎn)性能的影響

3 討論

飼料養(yǎng)分表觀消化率的高低跟育肥豬的生長性能密切相關(guān)，表觀消化率越高，育肥豬的生長性能就會(huì)越好。乳酸菌液體發(fā)酵飼料除提供豬的正常營養(yǎng)外，富含的乳酸菌可以將飼料中的粗蛋白、碳水化合物、粗纖維、氨基酸等降解為小肽、游離氨基酸和小分子營養(yǎng)物質(zhì)，有助于育肥豬對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。本試驗(yàn)表明，添加10%、30%和50%乳酸菌液體發(fā)酵飼料的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、鈣、總磷、氮表觀消化率顯著提高，差異顯著(P＜0.05)，證明乳酸菌液體發(fā)酵飼料有助于育肥豬對(duì)飼料營養(yǎng)成分的消化吸收，提高了豬的生產(chǎn)性能，這與劉瑞麗等[11]和張宇紅[12]的研究結(jié)果一致。

Canibe 等[13]和Van Winsen 等[14]研究表明，飼喂發(fā)酵飼料能顯著降低小腸中大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量。陳鮮鑫等[15]研究表明，生長豬飼喂乳酸菌發(fā)酵液體飼料較飼喂干料和濕拌料，可顯著提高豬糞中乳酸菌含量，顯著降低大腸桿菌和沙門氏菌含量。李清定等[16]的試驗(yàn)結(jié)果也證明，微生物發(fā)酵飼料能夠顯著提高生長豬糞便中乳酸菌含量，降低大腸桿菌含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加乳酸菌液體發(fā)酵飼料的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，鮮糞中大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量顯著降低，乳酸菌的數(shù)量顯著提高，差異顯著(P＜0.05)，與前述的研究結(jié)果一致。

乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬血液生化指標(biāo)影響的相關(guān)報(bào)道較少。朱坤等[1]報(bào)道用唾液乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌制作的發(fā)酵飼料可使育肥豬的血清中總蛋白和尿素氮含量顯著升高(P＜0.05)，總膽固醇、甘油三酯和葡萄糖含量無顯著差異(P＞0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸菌液體發(fā)酵飼料顯著提高了血液中總蛋白、白蛋白、葡萄糖的含量，顯著降低了尿素氮的含量，總膽固醇和三酰甘油含量降低不顯著，與前述的研究結(jié)果不完全一致。血清中總蛋白含量反映了機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收狀況以及與體液免疫的關(guān)系。白蛋白是構(gòu)成血漿膠體滲透壓的主體和血液中水溶性較低物質(zhì)的運(yùn)輸載體，對(duì)肝臟在蛋白質(zhì)代謝中起著重要作用[17]。血液中的葡萄糖為機(jī)體蛋白質(zhì)的合成提供能量，其含量越高代表機(jī)體利用血糖進(jìn)行蛋白質(zhì)合成和代謝能力越強(qiáng)。嚴(yán)念東等[18]認(rèn)為，血清尿素氮含量可以較準(zhǔn)確地反映動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸之間的平衡狀況，氨基酸平衡良好時(shí)血清尿素氮含量下降。本試驗(yàn)結(jié)果說明，乳酸菌液體發(fā)酵飼料有助于育肥豬蛋白質(zhì)的合成和代謝。Lye 等[19-20]對(duì)5株乳桿菌研究發(fā)現(xiàn)，通過降低體內(nèi)合成酶活性和同化膽固醇的途徑來降低動(dòng)物血液中膽固醇含量，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。甘油三酯作為血液中的一種脂肪類物質(zhì)，大部分是從飲食中獲得的，甘油三酯過高，有利于育肥豬脂肪的積累，增加肥肉部位的比例。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)育肥豬血液中免疫球蛋白M無顯著影響，總蛋白、白蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G顯著升高，表明育肥豬的飼料中添加乳酸菌液體發(fā)酵飼料對(duì)蛋白質(zhì)的合成和免疫力的提高有促進(jìn)作用，與眾多研究結(jié)果一致[21-25]。

許多研究表明,乳酸菌發(fā)酵飼料可以顯著提高育肥豬平均日增重、平均日采食量和降低料肉比等，這與王長彥等[26]、金樁等[27]、Canibe 等[28]研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，末重、平均日增重和平均日采食量都有明顯增加，差異顯著(P＜005)。料肉比方面，試驗(yàn)組均有不同程度的降低，但僅添加10%乳酸菌液體發(fā)酵飼料組降低8.64%，與對(duì)照組差異顯著(P＜005)，究其原因可能為：乳酸菌液體發(fā)酵飼料在發(fā)酵過程中消除了飼料中部分植物性原料的抗?fàn)I養(yǎng)因子，將原料中的大分子降解為小分子，有利于豬對(duì)飼料營養(yǎng)成分的消化吸收，改善豬的生長性能。發(fā)酵飼料所具有的特殊風(fēng)味以及含有的乳酸等生物活性物質(zhì)可提高飼料的適口性，增加采食量。液體發(fā)酵飼料由于含水量較大，豬采食量雖然上去了，但營養(yǎng)性干物質(zhì)相對(duì)攝入不足，造成料肉比在添加10%、30%、50%乳酸菌液體發(fā)酵飼料的試驗(yàn)組有增高的趨勢(shì)。

乳酸菌在動(dòng)物體內(nèi)代謝產(chǎn)生的乳酸可降低腸道內(nèi)的氧化還原電位和pH 值，有害菌由于內(nèi)環(huán)境改變而逐漸死亡。乳酸菌使革蘭陰性菌和過氧化氫酶陽性細(xì)菌的生長受阻。乳酸菌產(chǎn)生的一些肽類，能夠抑制致病菌。乳酸菌還能通過產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，提高機(jī)體的抗病力[29]，這與本試驗(yàn)乳酸菌液體發(fā)酵飼料顯著降低育肥豬發(fā)病率相吻合。

4 結(jié)論

綜合本試驗(yàn)結(jié)果，在育肥豬的飼料中添加乳酸菌液體發(fā)酵飼料，粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、鈣、總磷、氮的表觀消化率顯著提高；鮮糞中大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量顯著降低，乳酸菌的數(shù)量顯著增加；顯著提高了血液中總蛋白、白蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、葡萄糖的含量，顯著降低了尿素氮的含量，總膽固醇、三酰甘油、免疫球蛋白M無顯著影響；平均日增重和平均日采食量明顯增加，料肉比顯示添加10%乳酸菌液體發(fā)酵飼料飼料報(bào)酬率為最佳；顯著降低了育肥豬發(fā)病率。