王志君，陳禮治，王 卓

(海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433)

伏立康唑(voriconazole)是在氟康唑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上合成的三唑類廣譜抗真菌藥，臨床上主要用于治療由曲霉菌、念珠菌、隱球菌和組織胞漿菌引起的系統(tǒng)性真菌感染，也可用于治療肝移植術(shù)后的侵襲性真菌感染。伏立康唑在水中幾乎不溶解，美國輝瑞制藥公司研制開發(fā)的注射用伏立康唑中采用磺丁基-β-環(huán)糊精鈉(陰離子型高水溶性環(huán)糊精衍生物)包合藥物分子，形成非共價復(fù)合物，可增加其溶解性，提高藥物的穩(wěn)定性和水溶性。四川美大康華康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的注射用伏立康唑，采用專用溶媒(乙醇∶丙二醇=1∶1)溶解伏立康唑后，再將溶液加至生理鹽水中。伏立康唑的血藥濃度測定方法如高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)已有文獻報道[1-2]，同時有深入的藥動學(xué)研究[3]，以及不同輔料對伏立康唑影響的研究[4-5]，但伏立康唑氮氧化物的體內(nèi)藥動學(xué)研究報道較少[6]。本研究建立了同時測定伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的HPLC-MS/MS法，并考察大鼠注射不同溶媒制備的伏立康唑注射劑后，伏立康唑及其代謝物伏立康唑氮氧化物在大鼠體內(nèi)的組織分布。

1 材料和方法

1.1 儀器 G6410A液質(zhì)聯(lián)用儀、Agilent Mass Hunter分析軟件[安捷倫科技(中國)有限公司]；XW-80A渦旋混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；5804R低溫冷凍離心機(轉(zhuǎn)子型號F45-30-11，離心半徑95 mm)、MiniSpin離心機(離心半徑60 mm，Eppendorf中國有限公司)；AG285電子分析天平、PB-10酸度計(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；DL-180A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。

1.2 試劑和藥品 伏立康唑?qū)φ掌?純度99.2%，批號100862-201402)、氟康唑?qū)φ掌?純度99.7%，批號100314-201605)均購自中國食品藥品檢定研究院；伏立康唑氮氧化物(純度99.7%,Toronto Research Chemicals Inc.，批號Ch 100314-201605)；注射用伏立康唑A(0.1 g/瓶，四川美大康華康藥業(yè)有限公司，批號18042219，專用溶媒批號18042826)；注射用伏立康唑B(0.2 g/瓶，美國輝瑞制藥有限公司，批號2521601)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia公司)；乙酸和乙酸銨等其他試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

1.3 動物 雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量170～230 g，清潔級,購自海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[實驗動物合格證號：SCXK(蘇)2018-0002]，飼養(yǎng)溫度(23±2) ℃，濕度45%～75%，每12小時交替照明，自由飲水、飲食。

1.4 色譜條件和質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱為ACE C18-AR柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.2%乙酸水溶液(內(nèi)含20 mmol/L乙酸銨)，體積比為80∶20；流速0.5 ml/min；進樣量1 μl；柱溫40 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)；在正離子檢測方式下選擇多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描進行二級質(zhì)譜分析；質(zhì)譜檢測：毛細管電壓3.6 kV；霧化器壓力206.8 kPa(30 psi)；離子源溫度100 ℃，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min。用于定量分析中的離子反應(yīng)：伏立康唑[M+H]+m/z350.2(母離子)→281.0 (子離子),裂解器電壓和碰撞能量分別為124 V和12.0 eV；伏立康唑氮氧化物[M+H]+m/z366.1(母離子)→224.0(子離子)，其裂解器電壓和碰撞能量分別為100 V和8.0 eV；氟康唑[M+H]+m/z307.1(母離子)→220.1(子離子)，其裂解器電壓和碰撞能量分別為130 V和14.0 eV。

1.5 對照品儲備液的制備 稱取伏立康唑、伏立康唑氮氧化物和內(nèi)標氟康唑?qū)φ掌犯?0 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/ml的3種對照品儲備液，置于4～8 ℃冰箱，備用。

1.6 樣品采集

1.6.1 血漿樣品 取12只大鼠，以隨機數(shù)字表法隨機分成兩組，每組6只，實驗前禁食12 h，可自由飲水。按40 mg/kg劑量分別從尾靜脈注射A、B兩種伏立康唑注射劑[7]，于給藥前，給藥后5、30 min，1、2、4、6、8、12、24 h經(jīng)眼眶靜脈叢取血約0.5 ml，置于肝素化EP管中，604×g離心5 min后取血漿，于-80 ℃保存，備用。

1.6.2 組織樣品 取60只大鼠，隨機分成兩組，每個時間點平行設(shè)定3只，實驗前禁食12 h，可自由飲水。按40 mg/kg劑量分別從尾靜脈注射A、B兩種伏立康唑注射劑，于給藥前，給藥后5、30 min，1、2、4、6、8、12、24 h處死大鼠，取出心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦組織，洗去殘余血液，去除多余的結(jié)締組織，用生理鹽水清洗干凈，濾紙吸干表面水分，稱重。

1.7 樣品前處理

1.7.1 組織勻漿上清液的制備 精密稱取各組織1.0 g，不足1.0 g取全量，加入2 ml生理鹽水制備組織勻漿，將組織勻漿以1.13×104×g離心5 min，取上清液，即為組織勻漿上清液，置于-80 ℃低溫冰箱備用。

1.7.2 血漿和組織勻漿上清液樣品的前處理 取待處理血漿和組織勻漿上清液樣本各200 μl，加入甲醇溶液600 μl，振蕩2 min，1.13×104×g離心10 min，取200 μl上清液置EP管中，再加入0.2%乙酸溶液(含50 mmol/L乙酸銨)和甲醇溶液(含5 μg/ml內(nèi)標)各200 μl，渦旋混合20 s，轉(zhuǎn)移至進樣瓶，按1.4項下色譜條件和質(zhì)譜條件進樣分析。

1.8 動物行為觀察 取12只大鼠，隨機分成兩組，每組6只，實驗前禁食12 h，可自由飲水。按40 mg/kg劑量分別從尾靜脈注射A、B兩種伏立康唑注射劑，分別于給藥后24 h觀察動物行為，記錄大鼠是否身體殘缺、相互攻擊或死亡等。

1.9 數(shù)據(jù)處理 采用Phoenix WinNolin 64(版本8.1.0.3530)數(shù)據(jù)處理軟件的非房室模型，以統(tǒng)計矩法進行藥動學(xué)參數(shù)的計算，采用R軟件3.5.1版本做統(tǒng)計學(xué)分析，藥動學(xué)參數(shù)的比較采用t檢驗，組織分布的比較采用配對t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)譜分析 取伏立康唑?qū)φ掌啡芤?20 μg/ml)、伏立康唑氮氧化物對照品溶液(20 μg/ml)和內(nèi)標氟康唑溶液(5 μg/ml)，進行碎片分析，得到二級質(zhì)譜掃描圖，見圖1。

2.2 方法專屬性 分別取空白血漿、加入混合對照品的模擬血漿樣品和給藥后1 h的血漿樣品，按1.7項下方法進行前處理，按1.4項的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟康唑、伏立康唑氮氧化物和伏立康唑的保留時間分別為3.2、3.3和3.9 min，見圖2?？瞻籽獫{和流動相中干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)值的20%，并低于內(nèi)標響應(yīng)值的5%，表明雜質(zhì)對3種組分的測定無干擾。

圖1 伏立康唑、伏立康唑氮氧化物和氟康唑的二級質(zhì)譜圖Figure 1 Mass spectrograms of voliconazole,voliconazole nitrogen oxides and fluconazoleA：伏立康唑；B：伏立康唑氮氧化物；C：氟康唑

圖2 伏立康唑、伏立康唑氮氧化物和氟康唑的HPLC-MS/MS譜圖Figure 2 HPLC-MS/MS chromatograms of voriconazole,voriconazole nitrogen oxides and fluconazole A:空白血漿；B:空白血漿+混合對照品溶液；C:血漿樣品(給藥后1 h)；1：伏立康唑氮氧化物；2：伏立康唑；3：氟康唑

2.3 標準曲線的建立 精密吸取大鼠空白血漿，心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和腦組織的組織勻漿液各200 μl，分別精密加入不同濃度的混合對照品溶液，得到系列對照組織樣品，制備含伏立康唑、伏立康唑氮氧化物分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40 μg/ml的系列對照血漿和組織樣品，按1.7項下方法進行前處理，按1.4項的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測。以伏立康唑或伏立康唑氮氧化物與內(nèi)標氟康唑面積的比值(y)對血漿濃度(x)進行線性回歸，從而得到線性回歸方程。結(jié)果表明，所測成分在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

表1 大鼠血漿和組織中伏立康唑和伏立康唑 氮氧化物的線性回歸方程Table 1 Linear regression equations of voriconazole and voriconazole nitrogen oxides in rat plasma and tissues (n=11)

2.4 定量限和最低檢測限 按照樣品處理方法，配制系列不同濃度的血漿樣品溶液，進行樣品處理后進樣分析。以信噪比(S/N)≥10的檢測濃度作為定量限，伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的定量限分別為0.6和10 ng/ml。以S/N≥3的檢測濃度為最低檢測限，伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的最低檢測限分別為0.2和2.5 ng/ml。

2.5 精密度實驗和回收率實驗

2.5.1 批內(nèi)回收率和精密度 取200 μl大鼠空白血漿及200 μl各組織空白勻漿液配制以下系列濃度樣品：(1)伏立康唑定量下限(血漿為0.02 μg/ml，組織為0.01 μg/ml)、低濃度(0.05 μg/ml)、中濃度(2 μg/ml)、高濃度(血漿為40 μg/ml，組織為20 μg/ml)；(2)伏立康唑氮氧化物定量下限(血漿、腎臟、腦組織為0.02 μg/ml，心臟、肝臟、脾臟、肺為0.05 μg/ml)，低濃度(血漿、腎臟、腦組織為0.05 μg/ml，心臟、肝臟、脾臟、肺為0.1 μg/ml)，中濃度(血漿、腎臟、腦組織為1 μg/ml，心臟、肝臟、脾臟、肺為2 μg/ml)，高濃度(血漿為40 μg/ml，心臟、肝臟、脾臟、肺為5 μg/ml，腎臟、腦組織為2 μg/ml)。根據(jù)當日的標準曲線測定質(zhì)控樣品的絕對回收率。絕對回收率=實測濃度/實際加樣濃度×100%。結(jié)果表明，伏立康唑批內(nèi)回收率>85%，RSD<9.6%(n=5)；伏立康唑氮氧化物批內(nèi)回收率>87.2%，RSD<8.1%(n=5)。

2.5.2 批間回收率和精密度 分別配制3批2.5.1項下4種濃度的質(zhì)控血漿和各組織樣品殘渣復(fù)溶液，每一濃度取5個樣本，按1.7項下方法進行前處理，按1.4項的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測，分3 d進行測定，把測定的峰面積代入當天的標準曲線，計算質(zhì)控樣品的回收率。結(jié)果表明，伏立康唑批內(nèi)回收率>88.5%，RSD<7.7%(n=5)；伏立康唑氮氧化物批內(nèi)回收率>89.1%，RSD<8.6%(n=5)。

2.6 穩(wěn)定性實驗 制備伏立康唑和伏立康唑氮氧化物低濃度(0.02 μg/ml)、高濃度(40 μg/ml)的血漿樣品，分別進行以下實驗。(1)凍融實驗：冰凍溫度-80 ℃，解凍溫度25 ℃，反復(fù)凍融3次，進行穩(wěn)定性實驗。(2)長期冷凍實驗：將含藥血漿樣品于-80 ℃放置1個月后進行穩(wěn)定性實驗。(3)血漿樣品處理后48 h穩(wěn)定性實驗：將血漿樣品按1.7項下方法進行前處理，室溫下保存48 h，按1.4項的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測，每一濃度取5個樣本，把測定的峰面積代入當天的標準曲線，計算回收率。結(jié)果表明，在3種穩(wěn)定性實驗中，伏立康唑的回收率>91.5%，RSD<8.6%(n=5)；伏立康唑氮氧化物的回收率>93.1%，RSD<9.1%(n=5)。表明血漿樣品反復(fù)3次凍融后穩(wěn)定性良好；血漿樣品在-80 ℃條件下至少可以保存1個月；血漿樣品處理后可在室溫下保存48 h。結(jié)果顯示，待測組分在大鼠血漿中的穩(wěn)定性符合生物樣品的檢測要求。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)考察 取6批空白血漿，制備伏立康唑和伏立康唑氮氧化物低濃度(0.02 μg/ml)、高濃度(40 μg/ml )的血漿樣品，按1.7項下方法進行前處理，按1.4項的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測，每一濃度取5個樣本，把測定的峰面積代入當天的標準曲線，計算回收率。伏立康唑的RSD<9.2%，伏立康唑氮氧化物的RSD<10.1%(n=5)。

2.8 藥動學(xué)實驗 把12只Wistar大鼠隨機分為兩組，分別從尾靜脈注射兩種伏立康唑注射劑后，于系列時間點取血漿，按1.7項下方法進行前處理，按1.4項的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測，得到藥動學(xué)參數(shù)，見表2，平均血漿藥物濃度-時間曲線圖見圖3。采用t檢驗對AUC0～24 h進行比較，結(jié)果無顯著性差異(伏立康唑P=0.144 8，伏立康唑氮氧化物P=0.860 8)，表明兩種伏立康唑注射劑的AUC0～24 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.9 組織分布實驗 精密吸取組織勻漿液按1.7項下方法進行前處理，按1.4項的色譜條件和質(zhì)譜條件檢測，把測定的峰面積帶入線性回歸方程，計算出給藥后大鼠各組織中伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的濃度和藥-時曲線下面積。各組織勻漿上清液中伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的藥物濃度-時間曲線見圖4，各組織中24 h藥物濃度-時間曲線下面積見圖5。由圖5可見，24 h內(nèi)伏立康唑的組織藥物累積濃度由大到小依次為肝臟>脾臟>心臟>腎臟>肺>腦組織，伏立康唑氮氧化物的組織藥物累積濃度由大到小依次為心臟>脾臟>肺>肝臟>腎臟>腦組織。兩種伏立康唑注射劑在心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和腦組織的總體暴露未見顯著性差異(P>0.05)，不排除在特定臟器中可能存在顯著性差異。

表2 兩種伏立康唑注射劑在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)Table 2 Pharmacokinetic parameters of two kinds of voriconazole injections in rats (n=6)

CL：清除率；AUC0～24 h：24 h藥物濃度-時間曲線下面積；AUMC：一階曲線下面積；MRT：平均滯留時間

圖3 伏立康唑和伏立康唑氮氧化物的平均血漿藥物濃度-時間曲線圖Figure 3 Average plasma drug concentration-time curves of voriconazole and voriconazole nitrogen oxidesA：伏立康唑；B：伏立康唑氮氧化物；○：國產(chǎn)制劑；●：進口制劑；

圖4 伏立康唑和伏立康唑氮氧化物在組織勻漿上清液中的藥物濃度-時間曲線Figure 4 The average drug concentration-time curves of voriconazole and voriconazole nitrogen oxides in tissue homogenate supernatantA：心臟；B：肝臟；C：脾臟；D：肺 E：腎臟；F：腦組織;○：伏立康唑(國產(chǎn)制劑)；●：伏立康唑(進口制劑); △：伏立康唑氮氧化物(國產(chǎn)制劑);▲：伏立康唑氮氧化物(進口制劑)；

圖5 各組織中24 h藥物濃度-時間曲線下面積Figure 5 Area under the curve in each observed tissue within 24 hoursA：伏立康唑；B：伏立康唑氮氧化物；□：國產(chǎn)制劑；■：進口制劑；

2.10 動物行為 對兩組共12只Wistar大鼠分別從尾靜脈注射兩種伏立康唑注射劑后進行24 h觀察。(1)0 h：國產(chǎn)制劑組1只大鼠昏厥，進口制劑組無大鼠昏厥。(2)12 h：國產(chǎn)制劑組3只大鼠的尾部變黑，毛發(fā)蓬松，縮肩拱背，拒俘反射遲鈍；進口制劑組1只大鼠的尾部變黑。(3)24 h：國產(chǎn)制劑組2只大鼠斷尾，4只大鼠尾部變黑，出現(xiàn)燒灼創(chuàng)傷，2只大鼠進行攻擊，1只大鼠死亡；進口制劑組1只大鼠尾部變黑，出現(xiàn)燒灼創(chuàng)傷，未觀察到大鼠相互攻擊，無死亡。

3 討 論

目前，伏立康唑的劑型有口服制劑和注射劑等，其口服生物利用高，對曲霉屬、念珠菌屬、足放線病菌屬和鐮刀菌屬的真菌感染有臨床療效，是治療肺霉曲病的首選藥物。伏立康唑主要在肝臟通過CYP450的同工酶CYP2C19代謝[8]，主要代謝產(chǎn)物為無抗菌活性的伏立康唑氮氧化物，血漿中約占72%[9]。

進口和國產(chǎn)伏立康唑注射液的溶媒不同，為考察溶媒是否影響伏立康唑注射液在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)和組織分布，設(shè)計單周期單劑量尾靜脈注射，考察藥動學(xué)和組織分布情況。結(jié)果表明，國產(chǎn)和進口伏立康唑注射液的tmax和cmax一致，伏立康唑的平均藥-時曲線有雙峰現(xiàn)象，符合非線性代謝特點，因靜脈給藥，排除胃對藥物多時間和多部位吸收造成雙峰現(xiàn)象的可能性。伏立康唑為脂溶性藥物， 進入血液后，部分藥物分布到內(nèi)臟組織中，當代謝到一定程度時，組織中的藥物重新釋放進入血液，可能是造成雙峰現(xiàn)象的主要原因。故此情況下，以t1/2作為主要的藥動學(xué)參數(shù)不太合理。兩種注射劑的藥動學(xué)參數(shù)無顯著性差異，因此兩種注射劑在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)表現(xiàn)相似，增溶劑未從本質(zhì)上改變血漿中伏立康唑的藥動學(xué)行為。

兩種注射劑在大鼠體內(nèi)的組織分布類似，伏立康唑在肝臟中濃度最高，其余組織中濃度相差不大；伏立康唑氮氧化物在肺、肝臟和心臟中濃度更高，腎臟和腦組織中的濃度更低。伏立康唑的組織藥物濃度-時間曲線也有雙峰現(xiàn)象，同時觀察到伏立康唑(進口制劑)血藥濃度在12 h內(nèi)的下降速度比國產(chǎn)制劑更快，但國產(chǎn)制劑對大鼠的刺激性更大，分析原因可能是國產(chǎn)制劑以乙醇-丙二醇=1∶1為溶媒，且采用靜注方式給藥。本研究由于實驗動物樣本量的限制，只對單劑量給藥進行考察，實驗結(jié)果具有一定的局限性，需要進一步深入研究。