屈尚藍(lán)，任偉偉，宋流東，馮維楊

1昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650500

視黃酸(retinoic acid，RA)是天然維生素A在哺乳動(dòng)物體內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性衍生物，包括全反視黃酸(all-trans-retinoic acid，atRA)、9-順式視黃酸(9-cis-retinoic acid，9-cis-RA)和13-順式視黃酸(13-cis-retinoic acid，13-cis-RA)三種異構(gòu)體，三者可相互轉(zhuǎn)變[1]。RA不僅防癌、抗癌，在脂代謝調(diào)節(jié)中也具有重要作用[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸X受體(retinoid x receptors，RXRs)與過氧化物酶體增殖激活物受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)所形成的異源二聚體在脂代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[1-4]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，RXRs包括RXRα,RXRβ和RXRγ三種亞型，9-cis-RA是RXRs的天然配體[1]。

L-肉堿在真核細(xì)胞的脂肪酸分解代謝中起著不可或缺的作用，其主要功能是作為載體將活化脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中進(jìn)行β-氧化。在哺乳動(dòng)物中，參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿可以由生物體自身合成[6]。γ-丁基甜菜堿雙加氧酶(γ-butyrobetainedioxygenase,γ-BBD,EC 1.14.11.1)是大鼠和人肉堿生物合成途徑中一個(gè)重要的關(guān)鍵酶，主要在肝臟中催化γ-甜菜堿到L-肉堿的立體特異性羥化[6]。研究發(fā)現(xiàn)，γ-BBD抑制劑能抑制L-肉堿的生物合成并降低脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化率[7,8]。這些研究表明，γ-BBD在大鼠和人肝臟中所催化的反應(yīng)對(duì)肉堿合成及脂肪酸氧化分解具有重要作用。

據(jù)報(bào)道，肝癌細(xì)胞具有明顯的脂代謝重編程現(xiàn)象[9,10]，而且多項(xiàng)研究已表明RA能增強(qiáng)脂肪酸分解代謝[4,11,12]。但是，γ-BBD的表達(dá)在肝癌細(xì)胞內(nèi)是否隨脂代謝調(diào)節(jié)而被調(diào)節(jié)、是否受RA影響目前尚不清楚。本研究用二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)建立大鼠原發(fā)性肝癌模型，通過western blotting等技術(shù)研究了肝癌模型組織中γ-BBD的基因表達(dá)；探討了13-cis-RA對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞γ-BBD基因表達(dá)的影響，為闡明RA對(duì)肝癌細(xì)胞肉堿合成的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

RH-35大鼠肝癌細(xì)胞(KCB 92022YJ)，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滇)K2015-0002，動(dòng)物合格證號(hào)：53004100000036。

1.3 試劑

N-Nitrosodiethylamine(sigma,N0756)；13-cis-RA(sigma,R3255)；DMEM,High Glucose,GlutaMAXTM,Pyruvate(Gibco,10569010)；胎牛血清(Gibco,10270106)；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(索萊寶,T1300)；1×PBS緩沖液(PH7.2～7.4)(索萊寶,P1020)；RIPA組織細(xì)胞裂解液(索萊寶,R0010)；BCA蛋白定量試劑盒(天根,PA115)；Anti-Actin antibody(SAB,21338)；Anti-Gamma-Butyrobetaine Dioxygenase antibody(abcam,ab96348)；Anti-Retinoid X Receptor Gamma antibody(abcam,ab53162)；Goat Anti-Rabbit IgG-Hrp conjugated(SAB,L3012)；Pro-light HRP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(天根，PA112)；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天，C1052)；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根,DP413)；TRNzolA+總RNA提取試劑(天根,DP421)；Recombinant DNase I(寶生物，2270A)；RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo,K1632)；LightCycler?480 SYBR Green I Master(Roche,04707516001)。

1.4 儀器

超高速流式細(xì)胞分析分選工作站(Partec,德國(guó))；微量核酸蛋白定量?jī)x(BDT,美國(guó))；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7300,美國(guó))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DEN誘發(fā)肝癌

40只雄性SD大鼠，體重160～180 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)4天后，隨機(jī)分為肝癌模型組(n=20)和正常對(duì)照組(n=20)。在常規(guī)飲食、飲水基礎(chǔ)上，模型組腹腔注射50 mg/kg公斤體重DEN[13]，每周一次；正常對(duì)照組腹腔注射0.9%NaCl溶液，每周一次。DEN誘導(dǎo)肝硬化和肝癌形成期間，每?jī)芍芴幩酪恢淮笫?，跟蹤觀察肝硬化和肝癌形成情況，至16周后將所有動(dòng)物處死。

2.2 肝組織HE染色

肝組織用(10%)甲醛固定、脫水、石蠟包埋切片，按常規(guī)操作用蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM于5%CO2、37 ℃條件下傳代培養(yǎng)RH-35細(xì)胞。待細(xì)胞在25 cm2直角斜頸培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿后，棄去培養(yǎng)基，用1×PBS緩沖液(pH7.2～7.4，0.01 mmol/L)清洗細(xì)胞兩次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，待大部分細(xì)胞變成圓形時(shí)輕輕拍打培養(yǎng)瓶使細(xì)胞懸浮，然后立即加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化。將胰蛋白酶消化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中1 000 rpm離心5 min，棄去上清液，加入13 mL完全培養(yǎng)基并吹打均勻，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板或25 cm2直角斜頸培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右時(shí)，視黃酸處理組細(xì)胞在培養(yǎng)基中加入13-cis-RA使其終濃度為1 μmol/L[14,15]，對(duì)照組細(xì)胞在培養(yǎng)基中按常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期

視黃酸處理組(n=3)于13-cis-RA處理大鼠肝癌細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組細(xì)胞(n=3)一起以PI單染法流式細(xì)胞術(shù)分析RH-35細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。所有細(xì)胞用胰酶消化收集后，經(jīng)PBS溶液洗滌并加入1 mL冰浴預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定12～24 h，細(xì)胞再經(jīng)PBS洗滌后加入按細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作配制好的碘化丙啶染色液0.5 mL，37 ℃避光溫浴30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析DNA含量和細(xì)胞周期進(jìn)程。

2.5 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)γ-BBD和RXRγ翻譯水平的表達(dá)

通過Western blotting技術(shù)對(duì)DEN誘發(fā)的肝癌模型組(n=12)、正常肝組織對(duì)照組(n=13)的γ-BBD和RXRγ的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。分別在視黃酸處理12 h(n=8)、24 h(n=8)和48 h(n=8)后提取RA處理組和對(duì)照組(n=24)細(xì)胞總蛋白，通過western blotting技術(shù)對(duì)γ-BBD和RXRγ的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。肝組織按RIPA說明書每20 mg加入150～250 μL組織細(xì)胞裂解液，6孔板培養(yǎng)肝細(xì)胞按每孔細(xì)胞加入150～250 μL裂解液裂解肝細(xì)胞，裂解液經(jīng)離心后取上清用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取含35 μg總蛋白的裂解液于12%分離膠、5%濃縮膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用半干轉(zhuǎn)移法將總蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉溶液于室溫條件下封閉2 h，按抗體說明書加入適量I抗4 ℃孵育過夜，用含1‰Tween-20的TBS-T洗膜3次，再加入II抗(1∶10 000)室溫孵育2 h。用TBS洗膜2次，每次10 min。用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)半定量分析。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)γ-BBD和RXRγ轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

通過real-time PCR技術(shù)對(duì)DEN誘發(fā)的肝癌模型組(n=12)、正常肝組織對(duì)照組(n=13)的γ-BBD和RXRγ的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。分別在視黃酸處理24 h(n=8)和48 h(n=8)后提取RA處理組和對(duì)照組(n=16)細(xì)胞總RNA，通過real-time PCR技術(shù)對(duì)γ-BBD和RXRγ的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。肝組織總RNA提取按動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，培養(yǎng)肝細(xì)胞總RNA提取按TRNzol-A+總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。所有總RNA樣品先用瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)量，隨后定量、用DNAase I消化基因組DNA?？俁NA樣品再定量后按RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書操作將肝細(xì)胞內(nèi)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入RNA模板2 μg、1 μL通用引物Oligo(dT)18。所有cDNA溶液經(jīng)定量后按LightCycler?480 SYBR Green I Master說明書計(jì)算并配制PCR反應(yīng)體系，20 μLPCR反應(yīng)體系中引物的終濃度為0.5 μmol/L、cDNA模板加70 ng。每個(gè)樣本至少做3個(gè)平行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 min，60～62 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)45次。PCR反應(yīng)結(jié)束后，以β-actin作為內(nèi)參，用2-△△Ct定量方法對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行相對(duì)定量分析。β-actin、γ-BBD和RXRγ的引物序列見表1。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 DEN誘發(fā)大鼠原發(fā)性肝癌

在接受DEN給藥方案的大鼠中，大鼠肝臟的外觀于12周時(shí)開始出現(xiàn)明顯變化，肝表面失去原有光澤，顏色變淺、表面粗糙，可見部分結(jié)節(jié)(圖1A)。至DEN給藥14周時(shí)，肝表面更粗糙，且結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多、增大(圖1B)。于DEN給藥16周時(shí)，肝臟表面結(jié)節(jié)進(jìn)一步增多且出現(xiàn)數(shù)量較多的大結(jié)節(jié)(圖1C)，但對(duì)照組肝臟外觀無任何變化(圖1D)。取肝組織行HE染色組織學(xué)檢查，DEN處理14周時(shí)肝組織在光鏡下表現(xiàn)為肝臟內(nèi)彌漫性纖維組織增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，假小葉形成，小葉內(nèi)肝細(xì)胞排列雜亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)異型性(圖2A)。尤其是，在DEN處理16周后肝組織在光鏡下明顯表現(xiàn)為細(xì)胞大小不一，排列雜亂，細(xì)胞核大、深染，形態(tài)怪異，異型性細(xì)胞明顯增多，胞漿嗜堿性，血竇閉塞，部分細(xì)胞壞死(圖2B)；但0.9%NaCl給藥14周和16周的對(duì)照組肝細(xì)胞則有規(guī)律地排列成條索狀，細(xì)胞及細(xì)胞核大小一致，染色均勻(圖2C，2D)。以上實(shí)驗(yàn)表明按50 mg/kg公斤體重的DEN腹腔給藥方案在藥物作用14周時(shí)肝臟出現(xiàn)明顯肝硬化和組織增生，在藥物作用16周時(shí)大鼠肝組織在進(jìn)行性肝硬化基礎(chǔ)之上出現(xiàn)癌變的形態(tài)學(xué)變化。

表1 PCR反應(yīng)中使用的引物和條件

圖1 DEN處理的大鼠肝組織與對(duì)照肝組織Fig.1 Rat liver tissue treated with DEN and control liver tissue注：(A)DEN處理12周的肝組織；(B)DEN處理14周的肝組織；(C)DEN處理16周的肝組織；(D)0.9%NaCl處理16周的肝組織。Note:(A)Rat liver tissue treated with DEN for 12 weeks；(B)Rat liver tissue treated with DEN for 14 weeks；(C)Rat liver tissue treated with DEN for 16 weeks；(D)Rat liver tissue treated with 0.9%NaCl for 16 weeks.

圖2 肝組織HE染色(×400)Fig.2 Liver tissue HE staining(×400)注：(A)DEN處理14周的肝組織；(B)DEN處理16周的肝組織；(C)0.9%NaCl處理14周的肝組織；(D)0.9%NaCl處理16周的肝組織。Note:(A)Rat liver tissue treated with DEN for 14 weeks；(B)Rat liver tissue treated with DEN for 16 weeks(C)Rat liver tissue treated with 0.9%NaCl for 14 weeks；(D)Rat liver tissue treated with 0.9%NaCl for 16 weeks.

3.2 γ-BBD在DEN誘發(fā)的大鼠原發(fā)性肝癌中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，在接受DEN給藥方案的大鼠中，肝癌模型組γ-BBD的蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖3)；熒光定量PCR分析也發(fā)現(xiàn)肝癌模型組γ-BBD的mRNA豐度明顯低于對(duì)照組(P<0.05)(圖4A)。這些結(jié)果表明，DEN誘發(fā)的大鼠原發(fā)性肝癌細(xì)胞下調(diào)了γ-BBD的表達(dá)。

圖3 大鼠肝組織BBD的western blotting 分析Fig.3 Western blotting analysis of BBD in rat liver tissue

圖4 大鼠肝組織BBD和RXRγ的qRT-PCR 分析Fig.4 qRT-PCR analysis of BBD and RXRγ in rat liver tissue

3.3 RXRγ在DEN誘發(fā)的大鼠原發(fā)性肝癌中的表達(dá)

與對(duì)照組相比，肝癌模型組RXRγ的蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖5)，熒光定量PCR分析也發(fā)現(xiàn)RXRγ的mRNA豐度明顯低于對(duì)照組(P<0.05)(圖4B)。這些結(jié)果表明，DEN誘發(fā)的大鼠原發(fā)性肝癌細(xì)胞也下調(diào)了RXRγ的表達(dá)。

圖5 大鼠肝組織RXRγ的Western blotting 分析Fig.5 Western blotting analysis of RXRγ in rat liver tissue

3.4 13-cis-RA對(duì)RH-35細(xì)胞RXRγ表達(dá)的影響

RH-35細(xì)胞經(jīng)1 μmol/L13-cis-RA處理12～48 h后，與對(duì)照組比較，RXRγ的蛋白表達(dá)水平顯著增加，13-cis-RA處理48 h后RXRγ蛋白表達(dá)水平增加最為顯著(P<0.05，圖6)。為了進(jìn)一步確定13-cis-RA對(duì)RH-35細(xì)胞RXRγ表達(dá)的影響是否發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被用來分析RXRγ轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，結(jié)果顯示，在13-cis-RA處理24、48 h后，與對(duì)照組相比，13-cis-RA處理組RXRγmRNA的豐度明顯升高(P<0.05，圖7A)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，13-cis RA能誘導(dǎo)并上調(diào)肝癌細(xì)胞RXRγ的表達(dá)。

圖6 13-cis-RA對(duì)RH-35細(xì)胞RXRγ蛋白表達(dá)的影響Fig.6 The effects of 13-cis-RA on the expression of RXRγ protein in RH-35 cell

圖7 13-cis-RA對(duì)RH-35細(xì)胞γ-BBD mRNA和RXRγ mRNA表達(dá)的影響Fig.7 The effects of 13-cis-RA on the expression of γ-BBD mRNA and RXRγ mRNA in RH-35 cell

3.5 13-cis-RA對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

在用1 μmol/L的13-cis-RA處理大鼠肝癌細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比較，13-cis-RA處理組的細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)量分布明顯增加(P<0.05)，S期細(xì)胞數(shù)量分布顯著減少(P<0.05)(圖8)，細(xì)胞周期分析的定量結(jié)果也在表2中顯示。以上結(jié)果表明，1 μmol/L的13-cis-RA處理RH-35細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期明顯阻滯于G1期，大鼠肝癌細(xì)胞處于顯著的細(xì)胞增殖抑制狀態(tài)。

圖8 13-cis-RA對(duì)RH-35細(xì)胞周期進(jìn)程的影響Fig.8 The effects of 13-cis-RA on RH-35 cell cycle progression注：(A)對(duì)照組；(B)13-cis-RA處理組。Note:(A)Control group;(B)13-cis-RA-treated group.

表2 13-cis-RA對(duì)RH-35細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

注：與空白對(duì)照組相比，*P< 0.05。

Note:Compared with control group,*P< 0.05.

3.6 13-cis RA對(duì)RH-35細(xì)胞γ-BBD表達(dá)的影響

RH-35細(xì)胞經(jīng)1 μmol/L 13-cis-RA作用12～48 h后，與對(duì)照組比較，γ-BBD的蛋白表達(dá)水平顯著增加，13-cis-RA處理48 h后γ-BBD蛋白表達(dá)水平增加最為顯著 (P<0.05，圖9)。但是，γ-BBD的蛋白表達(dá)水平在13-cis-RA處理12 h組與13-cis-RA處理24 h組之間無顯著性差異(P> 0.05，圖9)。為了進(jìn)一步確定13-cis-RA對(duì)RH-35細(xì)胞γ-BBD表達(dá)的影響是否發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被用來分析γ-BBD轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在13-cis-RA處理24、48 h后，γ-BBD mRNA的豐度明顯升高(P<0.05，圖7B)。這些結(jié)果表明13-cis-RA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)了γ-BBD的表達(dá)。

圖9 13-cis-RA對(duì)RH-35細(xì)胞γ-BBD蛋白表達(dá)的影響Fig.9 The effects of 13-cis-RA on the of γ-BBD protein in RH-35 cell

4 結(jié)論

DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型因其誘癌成功率高，誘發(fā)癌變的病理變化過程與各種原因引起的大鼠和人肝細(xì)胞癌變過程相似而被廣泛應(yīng)用[13,16]。不管是什么原因引起的肝癌，其發(fā)展過程一般都要經(jīng)歷肝硬化—再生性結(jié)節(jié)—腺瘤性增生—早期肝癌—進(jìn)展期肝癌的病理變化過程[13,16]。臨床上或肝癌模型制備過程中常以肝臟宏觀的形態(tài)學(xué)變化、HE染色鏡下肝硬化形態(tài)學(xué)變化以及組織、細(xì)胞異型性增生的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)作為判斷典型癌變肝組織的重要指標(biāo)。本研究采用Seong Tae Park等[13]的研究方法制備大鼠原發(fā)性肝癌模型，肝臟于12周時(shí)開始出現(xiàn)肝硬化結(jié)節(jié)，至DEN給藥14周時(shí)，肝表面結(jié)節(jié)數(shù)增多、增大，HE染色可見彌漫性纖維組織增生、假小葉形成等典型的肝硬化表現(xiàn)。于DEN給藥16周時(shí)，肝臟表面出現(xiàn)明顯且數(shù)量較多的大結(jié)節(jié)，HE染色組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大小不一，排列雜亂，細(xì)胞核大、深染，形態(tài)怪異，異型性明顯。因此，至誘癌16周結(jié)束時(shí)，大鼠肝組織已表現(xiàn)出典型的肝硬化基礎(chǔ)上癌變的病理學(xué)特征。而且，這些進(jìn)行性變化的形態(tài)學(xué)特征與多項(xiàng)DEN誘發(fā)原發(fā)性肝癌的報(bào)道相似[13,16]。這說明50 mg/kg公斤體重的DEN腹腔給藥方案能成功誘發(fā)大鼠原發(fā)性肝癌。

L-肉堿作為脂肪酸分解代謝必不可少的載體，其合成有可能隨脂代謝重編程而被協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)。本研究用DEN誘發(fā)大鼠原發(fā)性肝癌，通過western blotting等技術(shù)分析了大鼠原發(fā)性肝癌模型γ-BBD的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)了γ-BBD在進(jìn)展期肝癌模型組織中轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)是下調(diào)的，提示，DEN誘發(fā)的大鼠原發(fā)性肝癌模型中的肉堿合成可能下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，γ-BBD是PPARα調(diào)控的靶基因[17]；另有研究還發(fā)現(xiàn)RXRγ活化和過表達(dá)能上調(diào)PPARα的表達(dá)[18]。因此，DEN誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌模型細(xì)胞中γ-BBD表達(dá)的調(diào)控模式可能與RXRγ的基因表達(dá)調(diào)控模式有關(guān)。本研究通過western blotting等技術(shù)證實(shí)了DEN誘發(fā)的大鼠原發(fā)性肝癌模型中RXRγ的表達(dá)是下調(diào)的，與γ-BBD的調(diào)控趨勢(shì)一致。提示，DEN誘發(fā)的原發(fā)性肝癌模型中γ-BBD的低表達(dá)調(diào)控模式可能與與RXRγ的低表達(dá)有關(guān)。

據(jù)報(bào)道，RA能上調(diào)RXRγ的表達(dá)[14,19,20]，因此RA干預(yù)有可能通過影響肝癌細(xì)胞RXRγ的表達(dá)進(jìn)而影響γ-BBD的表達(dá)。本研究證實(shí)了13-cis-RA在藥物誘導(dǎo)48 h這一時(shí)間點(diǎn)能顯著上調(diào)大鼠肝癌細(xì)胞RXRγ的表達(dá)。一些研究還發(fā)現(xiàn)RXRγ在癌細(xì)胞中低表達(dá)與癌發(fā)生、增殖以及低分化有關(guān)[15,19]，因此本研究用流式細(xì)胞術(shù)觀察RA對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，結(jié)果也表明在13-cis-RA作用48 h這一時(shí)間點(diǎn)，RH-35細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的G1期阻滯。提示，RA上調(diào)肝癌細(xì)胞RXRγ的表達(dá)可能與癌細(xì)胞重分化有關(guān)。在此基礎(chǔ)之上，本研究通過western blotting等技術(shù)檢測(cè)了13-cis-RA對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞γ-BBD表達(dá)的影響，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在RA作用48 h這一時(shí)間點(diǎn)，γ-BBD在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)均顯著上調(diào)。提示，13-cis-RA可能在誘導(dǎo)細(xì)胞重分化時(shí)期通過上調(diào)RXRγ的表達(dá)促進(jìn)PPARα表達(dá)，進(jìn)而影響了γ-BBD的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的PPARs不能直接調(diào)控靶基因，需與RXRs結(jié)合形成異二聚體才能發(fā)揮作用[1,2]，因此本研究中13-cis-RA還可能在細(xì)胞內(nèi)通過異構(gòu)成9-cis-RA后，與PPARs：RXRs中的RXRs連接直接活化該異二聚體[1,2,5,20,21]，進(jìn)而增強(qiáng)γ-BBD的轉(zhuǎn)錄。

綜上所述，DEN誘發(fā)的原發(fā)性大鼠肝癌模型有可能因γ-BBD下調(diào)而下調(diào)肉堿合成代謝；但是，13-cis-RA能上調(diào)γ-BBD的表達(dá)，因此13-cis-RA可能影響RH-35大鼠肝癌細(xì)胞的肉堿合成。13-cis-RA對(duì)γ-BBD表達(dá)的影響可能通過上調(diào)肝癌細(xì)胞RXRγ的表達(dá)，活化并增強(qiáng)PPARs：RXRs的轉(zhuǎn)錄活性而發(fā)揮作用。