TSK凝膠色譜系統(tǒng)測定多尼培南原料藥中高分子聚合物

李用珍，劉兆訊，王軍軍，張 英，王龍江*

（1.山東達(dá)因海洋生物制藥股份有限公司，山東 榮成 264300；2.威海海洋職業(yè)學(xué)院 食品工程系，山東 榮成264300）

多尼培南（doripenem，S-4661）為新型β-內(nèi)酰胺碳青霉烯類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、對多種G+菌和G-菌均有很強(qiáng)的抗菌活性[1-2]。該品種由日本鹽野義制藥株式會社開發(fā)，于2005年在日本上市，2007年10月美國FDA批準(zhǔn)該藥注射劑用于臨床治療多種細(xì)菌引起的復(fù)雜性腹腔內(nèi)感染及多種細(xì)菌引起的復(fù)雜性泌尿道感染。在β-內(nèi)酰胺類抗生素所致的速發(fā)型過敏反應(yīng)中，藥物分子本身只是半抗原，藥物中存在的高分子聚合物才是引發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)的真正過敏原[3]，控制β-內(nèi)酰胺抗生素中聚合物的含量是減少臨床中過敏反應(yīng)的有效措施[4]。彭潔等[5]采用高效液相色譜法（HPLC）發(fā)現(xiàn)注射用多利培南中的雜質(zhì)，并使用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）推測雜質(zhì)可能為多利培南的二聚物，但未對其他可能存在的高分子聚合物進(jìn)行控制。本文采用凝膠色譜法對多尼培南原料藥中的聚合物加以控制，對凝膠色譜柱、檢測波長、流動相等加以優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證，為確保多尼培南原料藥的質(zhì)量提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695-2489，e2695-2998高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AB204-S，AB265-S電子天平（梅特勒-托利多）；TSK-GEL G2000SW色譜柱（7.5 mm×600 mm，10 μm，Tosoh Corporation）；Sephadex G-10葡聚糖凝膠柱（10 mm×300 mm，40～120 μm，大連依利特）；pHS-3F型pH計(jì)（雷磁-上海儀電）。

1.2 試藥

無水磷酸二氫鈉，無水磷酸氫二鈉（分析純，國藥集團(tuán)）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；多尼培南原料藥（自制，批號：160801，160802，160803）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：TSK-GEL G2000SW（7.5 mm×600 mm，10 μm）葡聚糖凝膠柱；流動相：pH 7.0磷酸鹽緩沖液[5 mmol/L磷酸氫二鈉溶液-5 mmol/L磷酸二氫鈉溶液（61:39）]:乙腈=90:10，流速：0.7 ml/min，檢測波長：298 nm，柱溫：30 ℃。

取多尼培南供試品（批號：160801）約20 mg，精密稱定，置入10 ml量瓶，加0.01 mol/L NaOH溶液1 ml，室溫下放置5 min，加0.01 mol/L HCl中和后，加純化水溶解并定容至刻度。取上述堿破壞溶液20 μl注入液相色譜儀，理論塔板數(shù)按多尼培南峰計(jì)不低于3000，主峰與高分子聚合物峰的分離度≥1.5。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.2 供試品溶液制備

取供試品（批號：160801）約20 mg，精密稱定，置入10 ml量瓶，加純化水溶解并定容至刻度，搖勻制備成每1 ml約含2 mg的溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 強(qiáng)制破壞實(shí)驗(yàn) 取多尼培南供試品（批號：160801）適量，精密稱定，制成每1 ml約含2 mg的溶液 ，精密量取10 ml，按表2條件進(jìn)行強(qiáng)制破壞，以考察在各種降解條件下高分子聚合物對主成分的影響，結(jié)果見表1，圖2～5。

表1 多尼培南高分子聚合物強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果

圖2 堿破壞樣品與供試品HPLC圖譜對比

圖3 酸破壞樣品與供試品HPLC圖譜對比

圖4 氧化破壞樣品與供試品HPLC圖譜對比

圖5 高溫、高濕、光照破壞樣品與供試品HPLC圖譜對比

2.3.2 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品約20 mg，置入10 ml量瓶，精密稱定，加純化水溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1 ml約含2 mg的溶液，作為供試品溶液。室溫下，分別于0，1，2，3，4，5 h精密量取供試品溶液20 μl，注入色譜儀，考察供試品溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果表明室溫下5 h內(nèi)，不同時間點(diǎn)供試品主峰峰面積的相對偏差（RD）分別為-0.10 %，-0.36 %，-0.15 %，-0.19 %，-0.46 %，均小于0.5 %；高分子聚合物峰面積的RD分別為1.85 %，1.31 %，1.20 %，1.53 %，2.53 %，均小于5.0 %，符合要求。

2.3.3 檢測限和定量限 逐步稀釋供試品溶液，自動進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算信噪比。多尼培南溶液濃度約為0.04 μg/ml時，主峰的S/N為3～4，所測3份檢測限溶液峰面積的RSD≤10.0 %（0.72 %）；溶液濃度約為0.1 μg/ml時，主峰的S/N為9～10，所測6份定量限溶液的峰面積的RSD≤10.0 %（0.71 %）。

2.3.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 在0.1～8 μg/ml 濃度范圍內(nèi)選取1.007，2.014，4.028，6.042 ，8.056 μg/ml 5個濃度，以濃度（C，μg/ml）對峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=29 789C-1381.7，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。結(jié)果表明：多尼培南在0.1～8 μg/ml范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

2.3.5.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批多尼培南（批號：160801），精密稱定6份，按2.1項(xiàng)色譜條件測定，主峰前雜質(zhì)峰面積之和與樣品質(zhì)量的比值（A/M）的RSD為1.14（n=6），小于2.0 %，重復(fù)性滿足要求。

2.3.5.2 中間精密度試驗(yàn) 取同一批多尼培南，精密稱定12份，由兩位分析員分別在兩天、兩臺不同儀器上按2.1項(xiàng)色譜條件測定，A/M的RSD為1.59 %（n=12），小于2.0 %，中間精密度滿足要求。

2.3.6 耐用性試驗(yàn) 分別改變流速、流動相pH、乙腈比例及更換色譜柱，其余條件不變，分別制備系統(tǒng)適用性試液和供試品溶液，以系統(tǒng)適用性試驗(yàn)和供試品的檢測結(jié)果評價(jià)方法的耐用性，結(jié)果見表2。由表2可見，原色譜條件供試品檢測結(jié)果與改變色譜條件后檢測結(jié)果RD在±2 %以內(nèi)，說明此方法具有良好的耐用性。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測定

取本品（批號：160801，160802，160803）適量，按2.1項(xiàng)色譜條件測定樣品中的聚合物的含量，3批樣品中聚合物的含量分別為0.11 %，0.11 %，0.11 %。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

配制2 mg/ml多尼培南溶液，采用TSK-GEL G2000SW色譜柱，在液相色譜儀（PDA檢測器）上掃描200～400 nm區(qū)間的光譜圖。由圖譜可見，多尼培南主成分和主峰前的高聚物峰均在298 nm附近有最大吸收，故檢測波長選擇298 nm。

3.2 色譜柱的選擇

Sephadex G-10交聯(lián)葡聚糖凝膠柱在β-內(nèi)酰胺抗生素高分子聚合物的檢測中已得到廣泛應(yīng)用[6-13]。以2 mg/ml多尼培南溶液作為供試品溶液，分別采用Sephadex G-10（10 mm×300 mm，40～120 μm）及TSK-GEL G2000SW（7.5 mm×600 mm，10 μm）兩種凝膠色譜柱對多尼培南中的高分子聚合物進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，采用G-10凝膠柱時主峰峰展較寬，對于高分子雜質(zhì)分離不利；而TSKGEL G2000SW主峰的峰形較好，因其粒徑小導(dǎo)致其理論塔板數(shù)高，分離效率高，能有效分離高分子聚合物與主成分，故選擇TSK-GEL G2000SW作為多尼培南原料藥聚合物控制的色譜柱。

3.3 流動相pH的選擇

鑒于多尼培南在酸性或堿性，尤其是堿性條件下易降解，進(jìn)一步產(chǎn)生高分子聚合物雜質(zhì)，結(jié)合TSK-GEL G2000SW色譜柱適用范圍為2.5～7.5，分別選擇pH 7.0，6.5，6.0，5.5的磷酸緩沖鹽[5 mmol/L磷酸二氫鈉-5 mmol/L磷酸氫二鈉（61:39）]-乙腈=95:5）進(jìn)一步研究。結(jié)果顯示，隨著pH值的降低，主峰及高聚物的保留延后，從分離度及主成分的理論塔板數(shù)來看，pH值對高聚物的檢測無顯著影響，鑒于多尼培南在酸、堿性條件下均不穩(wěn)定，故選擇流動相的pH為7.0。

3.4 流動相離子強(qiáng)度的選擇

分別選擇0.005，0.01，0.05 mol/L不同離子強(qiáng)度的流動相進(jìn)行考察。隨著離子強(qiáng)度的增加，多尼培南高聚物因其自身的氨基、羧基發(fā)生解離，高聚物峰面積逐漸減小，故選擇檢測的離子強(qiáng)度選擇0.005 mol/L。

3.5 計(jì)算方法的選擇

由于高聚物本身不穩(wěn)定，對照品不易制備，以外標(biāo)法定量有一定的難度。選擇自身對照法（1 %自身對照溶液）和面積歸一化法進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。

表3 不同計(jì)算方式結(jié)果比較

由表3可見，自身對照法和面積歸一化法檢測聚合物結(jié)果變化不明顯，面積歸一化法檢測結(jié)果大于自身對照法檢測結(jié)果，選擇面積歸一化法計(jì)算聚合物含量。

4 結(jié)論

相對于第一代碳青霉烯類藥物在體內(nèi)易被腎脫氫肽酶（DHP-1）水解，多尼培南具有與細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白（PBPS）親和力強(qiáng)、抗菌活性高、對DHP-1穩(wěn)定的特點(diǎn)，具有更好的臨床應(yīng)用價(jià)值和市場前景，對多尼培南原料藥中的高分子聚合物進(jìn)行控制，是減少臨床致敏反應(yīng)的有效措施。本文采用TSK凝膠色譜系統(tǒng)，通過對檢測波長、色譜柱、流動相pH值及離子強(qiáng)度的篩選，初步建立了控制方法，并對其進(jìn)行了全面的方法學(xué)驗(yàn)證，該方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于多尼培南高分子聚合物的檢查。