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      反相離子對(duì)色譜法測定格列吡嗪片中5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量

      2019-11-05 11:34:12于小童
      食品與藥品 2019年5期
      關(guān)鍵詞:甲醇溶液格列液相色譜儀

      崔 靜,于小童

      (淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東 淄博 255086)

      格列吡嗪的化學(xué)名為1-環(huán)己基-3-{4-[2-(5-甲基吡嗪-2-酰胺)-乙基]苯磺酰}脲,是美國輝瑞公司開發(fā)的第二代磺酰脲類口服降糖藥,1984年在美國上市[1]。格列吡嗪主要應(yīng)用于2型糖尿病患者的治療,其作用機(jī)制為促胰島β細(xì)胞分泌胰島素[2]。

      《中國藥典》2015年版二部收載了格列吡嗪及其片劑,其有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)均只檢查4-[2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基]苯磺酰胺(雜質(zhì)Ⅰ)的含量[3],而可能存在的5-甲基吡嗪-2-羧酸既是格列吡嗪合成時(shí)使用的起始物料[1],又是格列吡嗪酰胺鍵斷裂時(shí)產(chǎn)生的雜質(zhì)[4],因此,監(jiān)控5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量對(duì)于格列吡嗪片的質(zhì)量控制非常有必要。由于5-甲基吡嗪-2-羧酸的酸性強(qiáng),中國藥典、美國藥典、歐洲藥典等收載的有關(guān)物質(zhì)檢查方法中的色譜系統(tǒng)中均不適于該雜質(zhì)的含量測定,因此,本文建立了反相離子對(duì)高效液相色譜法測定5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量[5-8]。

      1 儀器與試藥

      1.1 儀器

      1260 高效液相色譜儀,包含四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器(美國安捷倫);CP225D電子天平(德國賽多利斯);ML204電子天平(瑞士梅特勒)。

      1.2 試藥

      5-甲基吡嗪-2-羧酸(Sigma-Aldrich公司);格列吡嗪片(仁和堂藥業(yè),批號(hào):170901,171101,180504,規(guī)格:5 mg);甲醇(色譜純,默克股份兩合公司);10 %四丁基氫氧化銨溶液(分析純,上海麥克林);磷酸二氫鈉(分析純,國藥集團(tuán))。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 色譜條件

      色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流速:1.0 ml/min;檢測波長:276 nm;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:20 μl;流動(dòng)相A:50 mmol/LNaH2PO4溶液(含0.05 %四丁基氫氧化銨),流動(dòng)相B:甲醇,按表1梯度洗脫。

      表1 梯度洗脫表

      2.2 溶液的制備

      2.2.1 對(duì)照品貯備液的制備 取5-甲基吡嗪-2-羧酸對(duì)照品約25 mg,精密稱定,用5 %甲醇溶液溶解并稀釋制成每1 ml含12.5 μg的溶液。

      2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品貯備液,用5 %甲醇溶液溶解并稀釋制成每1 ml含0.5 μg的溶液。

      2.2.3 供試品溶液的制備 取格列吡嗪片10片,研細(xì),精密稱取適量(約相當(dāng)于格列吡嗪25 mg),置入50 ml量瓶,加5 %甲醇溶液適量,強(qiáng)力振搖并超聲15 min使5-甲基吡嗪-2-羧酸充分溶解,再加5 %甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液即得。

      2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液的制備 取格列吡嗪片10片,研細(xì),精密稱取適量(約相當(dāng)于格列吡嗪25 mg),置入50 ml量瓶,用對(duì)照品溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液即得。

      2.3 方法學(xué)考察

      2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取空白溶劑(5 %甲醇溶液)、系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液各20 μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖(見圖1)。結(jié)果:系統(tǒng)適用性溶液中主峰無相鄰雜質(zhì)峰,空白溶劑對(duì)5-甲基吡嗪-2-羧酸測定無干擾,該色譜條件適用于5-甲基吡嗪-2-羧酸含量的測定。

      圖1 HPLC色譜圖

      2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取對(duì)照品25.13 mg,用5 %甲醇溶液溶解并稀釋制成0.05026,0.1005,0.2513,0.5026,1.0052,1.5078,2.0104 μg/ml的溶液,分別精密量取20 μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),以濃度(X)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:Y=79 027.3X+6355.88(r=0.9999),表明在0.05026~2.0104 μg/ml范圍內(nèi),5-甲基吡嗪-2-羧酸濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

      2.3.3 定量限和檢測限 用5 %甲醇溶液將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋制成一系列不同濃度,分別精密量取20 μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖。當(dāng)信噪比約為10時(shí),作為定量限濃度。當(dāng)信噪比約為3時(shí),作為檢出限濃度。定量限為0.05026 μg/ml,檢測限為0.01508 μg/ml。

      2.3.4 系統(tǒng)精密度試驗(yàn) 取定量限溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,5-甲基吡嗪-2-羧酸峰面積RSD為0.5 %(n=6),表明精密度良好。

      2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)照品溶液和系統(tǒng)適用性溶液于室溫下放置,分別在0,2,4,6,8 h時(shí)精密量取20 μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖。對(duì)照品溶液主成分峰面積的RSD為0.8 %,系統(tǒng)適用性溶液主成分峰面積的RSD為0.3 %,溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

      2.3.6 準(zhǔn)確度 取格列吡嗪片(批號(hào):170901)適量,研細(xì),精密稱取適量(約相當(dāng)于格列吡嗪25 mg,5-甲基吡嗪-2-羧酸含量為0.0080 %),置入50 ml量瓶,平行稱取9份,每3份為一組,分別精密加對(duì)照品貯備液1,2,3 ml,加5 %甲醇溶液適量,強(qiáng)力振搖并超聲15 min,使5-甲基吡嗪-2-羧酸充分溶解,再用5 %甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液即得。按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定,平均回收率為99.20 %,RSD為0.9 %,表明準(zhǔn)確度良好,結(jié)果見表2。

      2.3.7 重復(fù)性 照2.2.3項(xiàng)方法,平行制備6份供試品溶液。精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。5-甲基吡嗪-2-羧酸平均含量為0.041 %,RSD為0.6 %,重復(fù)性良好。

      表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

      2.4 樣品測定

      取3批格列吡嗪片,批號(hào)分別為170901、171101、180504,照2.2.3項(xiàng)方法,配制供試品溶液,測得結(jié)果分別為0.0080 %,0.0084 %,0.0079 %。

      3 討論

      3.1 用二極管陣列檢測器提取5-甲基吡嗪-2-羧酸峰的紫外光譜,發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)的最大吸收波長為214 nm和276 nm。與214 nm相比276 nm波長處特征峰明顯,故選擇276 nm作為測定波長。

      3.2 本文建立的反相離子對(duì)高效液相色譜法,在0.05026~2.0104 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,檢出限為0.01508 μg/ml,本方法操作簡單、靈敏度好、結(jié)果可靠。較使用色譜用水(用醋酸調(diào)pH 3.5)為流動(dòng)相A、乙腈為流動(dòng)相B[8],本文的色譜條件分離效果更好。國內(nèi)無關(guān)于格列吡嗪片中5-甲基吡嗪-2-羧酸雜質(zhì)的檢測方法的參考文獻(xiàn)。經(jīng)驗(yàn)證,本文所建立的方法操作簡單、靈敏度好、結(jié)果可靠,適合用于格列吡嗪片中微量雜質(zhì)5-甲基吡嗪-2-羧酸的測定。

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