賀文煜，張海明，袁昌勁

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，全球胃癌一半以上均發(fā)生在中國(guó)，其發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌，居第2位［1］。由于絕大多數(shù)胃癌確診時(shí)已是中晚期［2］，化療成為中晚期和進(jìn)展期胃癌主要的治療手段。但是傳統(tǒng)化療效果并不理想，超過70%患者總體生存率低于1年，5年生存率低于5%［3］。針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）的小分子抑制劑阿帕替尼，可以特異性阻斷VEGFR2的ATP結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制腫瘤血管的生成和細(xì)胞的增殖［4］。研究顯示，阿帕替尼可以顯著提高中晚期胃癌患者生存率，對(duì)二線化療失敗的患者依然展現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢(shì)［5］。但是隨著阿帕替尼的廣泛使用，部分患者會(huì)出現(xiàn)阿帕替尼原發(fā)性耐藥或繼發(fā)性耐藥，進(jìn)而影響中晚期胃癌的療效。

高良姜素（Galangin，GLA）是從姜科植物高良姜中提取的一種黃酮類化合物，藥理學(xué)證實(shí)其具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種生物活性［6］，在乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤中展現(xiàn)出顯著的抗癌活性［7］。但是GLA聯(lián)合阿帕替尼對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用尚少見報(bào)道。本研究擬從細(xì)胞生物學(xué)行為角度出發(fā)，探討GLA能否增強(qiáng)阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用以及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；阿帕替尼購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；Matrigel膠和Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；BCA蛋白定量試劑盒、胰蛋白酶（0.25%）、RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人磷酸化蛋白激酶B（Akt）、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶（p-Akt）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；兔抗人p38、p-p38、GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)前處理 細(xì)胞培養(yǎng)傳代于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素+鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱。每隔24～48 h更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)48～72 h傳代1次。將GLA溶于DMSO溶液，配制成終濃度為0、10、20、40、80、160 mg/L的溶液；將阿帕替尼溶于DMSO溶液，配制成終濃度為0、5、10、15、20、25、30 mg/L的溶液；配制好的溶液置于4℃冰箱保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（0 mg/L溶液為空白對(duì)照組，不加任何藥物，僅加等體積DMSO溶液）。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板（4×103個(gè)/孔），再加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基使之終體積為100μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為0、100、200、300、400、500、600 mg/L GLA溶液和終濃度為0、5、10、15、20、25、30 mg/L阿帕替尼溶液。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，藥物作用48 h后向每孔中加入10μL MTT溶液，37℃孵育1.5 h后終止實(shí)驗(yàn)，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm處的吸光度（A）值。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板，待細(xì)胞75%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，加入相應(yīng)濃度的高良姜素和阿帕替尼，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集上清液，PBS沖洗3遍，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞；再將消化的細(xì)胞和貼壁細(xì)胞一并收集，加入冰PBS沖洗3遍，再加入500μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入5μL Annexin-V-FITC，避光室溫孵育15 min，再加入5μL PI孵育5 min，于1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將胃癌SGC-7901細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞60%～70%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基饑餓12 h，用200μL移液槍槍頭在培養(yǎng)板下劃痕，PBS沖洗3遍，再加入適宜濃度的高良姜素、阿帕替尼和新鮮培養(yǎng)基，分別于劃痕時(shí)和培養(yǎng)24 h時(shí)對(duì)劃痕線拍照，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0時(shí)邊緣距離-24 h時(shí)邊緣距離）/0時(shí)邊緣距離×100%。

1.6Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基按照1∶20稀釋Matrigel膠，向Transwell上室中加入60μL稀釋后Matrigel膠，37℃培養(yǎng)箱放置6 h。首先用不含血清的培養(yǎng)基水化上室1 h，細(xì)胞接種于不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，再加入相應(yīng)濃度的高良姜素和阿帕替尼。將細(xì)胞鋪于上室（1×104個(gè)細(xì)胞），使之終體積為200μL，下室中加入600μL RPMI-1640培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h，下室棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍，加入4%多聚甲醛，室溫靜置30 min固定，再加入0.5%結(jié)晶紫靜置10 min，蒸餾水沖洗，棉簽輕輕拭去表面細(xì)胞。隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照，并對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡及PI3K/Akt及p38-MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6 cm2的培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞60%～70%融合時(shí)棄去培養(yǎng)基，加入含有相應(yīng)濃度高良姜素和阿帕替尼的培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育36 h。加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒定量。再加入適量的蛋白緩沖液，沸水高溫變性，取40μg蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），轉(zhuǎn)膜，加入胎牛血清封閉30 min，加入一抗，4℃孵育12 h，包括Ak（t1∶1 000）、p-Ak（t1∶500）、p38（1∶200）、p-p38（1∶500）、Bax（1∶200）、Bcl-2（1∶200）、GAPDH（1∶1 000）；然后TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，孵育1.5 h，化學(xué)發(fā)光儀曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（組間多重比較采用LSD-t法）或兩因素析因設(shè)計(jì)資料方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1阿帕替尼聯(lián)合GLA對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示，加藥48 h后，阿帕替尼和高良姜素呈濃度依賴性地抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞活性；與空白對(duì)照組相比，20 mg/L阿帕替尼和400 mg/L高良姜素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞呈現(xiàn)明顯抑制作用（P＜0.05），見圖1A、B。為進(jìn)一步探討高良姜素對(duì)阿帕替尼的增效作用，選擇20 mg/L阿帕替尼聯(lián)合100、200、300、400、500、600 mg/L的高良姜素作用48 h。結(jié)果顯示，20 mg/L阿帕替尼聯(lián)合300 mg/L高良姜素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用明顯高于單獨(dú)應(yīng)用20 mg/L阿帕替尼（P＜0.05），見圖1C。因此，本研究選擇20 mg/L阿帕替尼聯(lián)合300 mg/L高良姜素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig.1 The inhibitory effect of apatinib combined with galangin ongastric cancer SGC-7901 cells圖1 阿帕替尼聯(lián)合高良姜素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用

2.2阿帕替尼聯(lián)合GLA對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移的影響 單獨(dú)使用20 mg/L阿帕替尼和300 mg/L高良姜素均明顯抑制SGC-7901細(xì)胞遷移（P＜0.01）；20 mg/L阿帕替尼聯(lián)合300 mg/L高良姜素對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移的抑制作用更加明顯（P＜0.05），見圖2、表1。

Fig.2 The inhibitory effect of apatinib combined with galangin on gastric cancer SGC-7901 cells圖2 阿帕替尼聯(lián)合高良姜素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用

Tab.1 The effect of apatinib combined with galangin on migration,invasion and apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells表1 阿帕替尼聯(lián)合GLA對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響 （n=3，±s）

Tab.1 The effect of apatinib combined with galangin on migration,invasion and apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells表1 阿帕替尼聯(lián)合GLA對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01：F1為單獨(dú)20 mg/L阿帕替尼主效應(yīng)的F值，F(xiàn)2為單獨(dú)300 mg/L高良姜素主效應(yīng)的F值，F(xiàn)3為20 mg/L阿帕替尼聯(lián)合300 mg/L高良姜素主效應(yīng)的F值

組別空白對(duì)照組20 mg/L阿帕替尼組300 mg/L高良姜素組阿帕替尼+高良姜素組F1F2F3細(xì)胞遷移率（%）1.07±0.04 1.29±0.17 1.36±0.13 1.96±0.05 42.450＊＊59.067＊＊9.030＊穿膜細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）55.33±1.53 78.67±4.04 107.33±2.52 149.33±4.51 282.471＊＊995.765＊＊23.059＊＊細(xì)胞凋亡率（%）6.09±0.04 17.90±2.64 9.43±0.06 22.73±0.35 9 545.859＊＊1 011.661＊＊33.771＊＊

2.3阿帕替尼聯(lián)合GLA對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲的影響 單獨(dú)使用20 mg/L阿帕替尼和300 mg/L高良姜素均明顯抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲（P＜0.01）；20 mg/L阿帕替尼聯(lián)合300 mg/L高良姜素對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移的侵襲作用更加明顯（P＜0.01），見圖3，表1。

Fig.3 The effect of apatinib combined with galangin on the invasion of gastric cancer SGC-7901 cells圖3 阿帕替尼聯(lián)合高良姜素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的遷移作用

2.4阿帕替尼聯(lián)合GLA對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 單獨(dú)使用20 mg/L阿帕替尼和300 mg/L高良姜素均明顯誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡（P＜0.01）；20 mg/L阿帕替尼聯(lián)合300 mg/L高良姜素對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用更加明顯（P＜0.01），見圖4、表1。

Fig.4 The effect of apatinib combined with galangin on the apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells圖4 阿帕替尼聯(lián)合高良姜素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡作用

2.5阿帕替尼聯(lián)合GLA對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，20 mg/L阿帕替尼組和300 mg/L高良姜素組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；與單用阿帕替尼比較，高良姜素聯(lián)合阿帕替尼組Bcl-2蛋白下調(diào)更明顯，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)更明顯（P＜0.05），見圖5A。與空白對(duì)照組比較，20 mg/L阿帕替尼組和300 mg/L高良姜素組p-Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，p-p38蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；與單用阿帕替尼比較，高良姜素聯(lián)合阿帕替尼組p-Akt蛋白下調(diào)更明顯，p-p38蛋白表達(dá)上調(diào)更明顯（P＜0.05），見圖5B。

3 討論

3.1GLA研究現(xiàn)狀 阿帕替尼屬于VEGFR2特異性抑制劑，是全世界第一個(gè)被證實(shí)對(duì)晚期胃癌有效的小分子靶向藥物。阿帕替尼對(duì)晚期胃癌及轉(zhuǎn)移性胃癌的療效已獲得充分肯定，但是隨著其廣泛使用，多數(shù)患者會(huì)發(fā)生耐藥［8］，給晚期胃癌患者的治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。阿帕替尼上市時(shí)間較晚（2014年SFDA批準(zhǔn)上市），對(duì)于其耐藥性的發(fā)生機(jī)制尚缺乏相關(guān)報(bào)道。GLA屬于黃酮類化合物，在姜科植物高良姜根部含量豐富。GLA具有多種藥理作用，特別在惡性腫瘤方面表現(xiàn)出明顯的活性。Xu等［9］證實(shí)GLA能誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與降低線粒體膜電位有關(guān)。GLA不僅自身具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用，還能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，提示其是一種潛在的化療增敏劑。但其能否提高胃癌細(xì)胞對(duì)阿帕替尼的敏感性尚鮮見報(bào)道。

3.2阿帕替尼聯(lián)合GLA對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的遷移、侵襲作用 本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用20 mg/L阿帕替尼和300 mg/L高良姜素均可以明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖，與Wu等［10］報(bào)道一致，說明高良姜素單藥也具有抗胃癌的藥理活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過活性篩選的300 mg/L高良姜素聯(lián)合20 mg/L阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用明顯優(yōu)于20 mg/L阿帕替尼單藥處理，提示高良姜素增強(qiáng)了阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用。Yu等［11］研究顯示GLA聯(lián)合順鉑可以呈劑量依賴性地抑制人肺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)GLA單藥可以抑制肺癌順鉑耐藥細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究也證實(shí)，GLA聯(lián)合阿帕替尼可以明顯增強(qiáng)對(duì)胃癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，提示其可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)阿帕替尼的敏感性。遷移和侵襲是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要原因，轉(zhuǎn)移性胃癌患者預(yù)后極差，且治療選擇有限。一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，阿帕替尼可以明顯改善轉(zhuǎn)移性胃癌的總生存期，研究者認(rèn)為這可能與阿帕替尼抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲表型有關(guān)［12］。本研究顯示，GLA聯(lián)合阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用明顯優(yōu)于單用阿帕替尼，說明GLA增強(qiáng)了阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制。Tolomeo等［13］也證實(shí)GLA可以增強(qiáng)伊馬替尼對(duì)慢性髓樣白血病細(xì)胞KCL22的毒性作用，并部分逆轉(zhuǎn)KCL22細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的耐藥性。

Fig.5 The effect of apatinib combine with galangin on expression levels of apoptosis and PI3K/Akt,MAPK related proteins of in gastric cancer SGC-7901 cells圖5 阿帕替尼聯(lián)合高良姜素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡及PI3K/Akt、MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3.3阿帕替尼聯(lián)合GLA對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡及作用機(jī)制 PI3K/Akt通路是調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和化療耐藥的主要途徑，其中Akt是PI3K/Akt通路的關(guān)鍵調(diào)控因子。Akt磷酸化后會(huì)激活一氧化氮合酶（NOS），并通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）介導(dǎo)腫瘤局部微血管形成。研究證實(shí)，包括胃癌在內(nèi)的多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和耐藥均與PI3K/Akt通路異?；罨嘘P(guān)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，GLA聯(lián)合阿帕替尼可以明顯下調(diào)p-Akt蛋白表達(dá)，提示其增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)阿帕替尼敏感性可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括JNK、ERK、p38等關(guān)鍵調(diào)控因子；其中p38受細(xì)胞因子、藥物、輻射等刺激而產(chǎn)生相應(yīng)作用，參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和進(jìn)展。Zheng等［15］研究顯示p38表達(dá)異常與腫瘤患者生存期顯著相關(guān)。活化的p38可以抑制Bcl-2活化和誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位，并通過誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，GLA聯(lián)合阿帕替尼可明顯上調(diào)pp38表達(dá)，并抑制Bcl-2蛋白表達(dá)和誘導(dǎo)Bax表達(dá)，提示其可能通過激活p38 MAPK通路增強(qiáng)阿帕替尼對(duì)胃癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

3.4總結(jié) GLA聯(lián)合阿帕替尼可以抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)GLA可能通過抑制PI3K/Akt通路和激活p38 MAPK通路增強(qiáng)阿帕替尼對(duì)胃癌的抑制作用。今后我們將建立裸鼠荷瘤模型，進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證GLA聯(lián)合阿帕替尼的抗胃癌作用。