人工老化對(duì)沙蔥種子中活性氧與超微弱發(fā)光的影響

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植保學(xué)院，內(nèi)蒙古野生特有蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 呼和浩特 010019)

種子老化(Seed aging)是指種子生存能力下降，使得種子喪失活力及萌發(fā)力的不可逆轉(zhuǎn)變化，是在種子成熟后發(fā)生和發(fā)展的、自然而不可避免的過程，其起因與有害物質(zhì)積累、內(nèi)源激素紊亂、生物大分子變性和膜系統(tǒng)損傷等有關(guān)。目前，關(guān)于種子老化的具體機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為老化過程會(huì)表現(xiàn)出種子活力降低，膜脂過氧化，保護(hù)酶、蛋白質(zhì)和核酸降解等特點(diǎn)[1]。因此，探究種子老化機(jī)理及如何緩解種子老化意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，種子在生產(chǎn)中肥料供給充足，種子貯藏時(shí)降低種子含水量，低溫、低濕貯藏等方法可以有效緩解種子老化[2]。沙蔥種子貯藏過程中易發(fā)生老化劣變，在老化過程中活性氧和超微弱發(fā)光如何響應(yīng)，是否可通過超微弱發(fā)光的強(qiáng)弱來無損傷的鑒定種子活力以及如何緩解種子的老化等問題未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過鈰離子+人工老化處理沙蔥種子，研究鈰離子對(duì)沙蔥老化種子的活性氧與超微弱發(fā)光的影響，以期為沙蔥種質(zhì)資源的保存提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試 材

以2016年采自鄂爾多斯市鄂托克前旗荒漠草甸的沙蔥(AlliummongolicumRegel.)種子為試材,千粒重為(2.28±0.06)g,初始含水量為(5.78±0.33)%。

1.2 浸種處理

選擇飽滿、大小一致、無破損的沙蔥種子，經(jīng)400 mg·L-1Ce3+(氯化亞鈰)浸種6 h后鋪在濾紙上室溫晾干。

1.3 人工老化處理

采用高溫高濕法對(duì)沙蔥種子進(jìn)行人工老化[3]，設(shè)定老化箱溫度50 ℃，相對(duì)濕度(RH)為100%。老化處理時(shí)間分別為0，5，15，25 h和35 h。經(jīng)Ce3+浸種后再人工老化處理分別記為Ce3+0、Ce3+1、Ce3+2、Ce3+3、Ce3+4；未經(jīng)Ce3+浸種直接老化的沙蔥種子分別記為ck0、ck1、ck2、ck3、ck4；老化完畢后取出種子，在室溫下晾干至其原始水分，然后密封保存在4 ℃冰箱中備用。

1.4 萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定

取處理好的沙蔥種子，用1%的次氯酸鈉溶液殺菌消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈后放在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿(d=9 cm)中進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，恒溫培養(yǎng)箱溫度為(20±1)℃，每皿50粒種子，4次重復(fù)。每隔24 h記錄發(fā)芽數(shù)并補(bǔ)水，第10天結(jié)束試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，測(cè)定鮮重以及胚根長(zhǎng)，計(jì)算發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

發(fā)芽勢(shì)(%)=(第3天發(fā)芽種子數(shù)/測(cè)定種子總數(shù))×100%[4]；

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/測(cè)定種子總數(shù))×100%[4]；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt，Gt為t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)[4]；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×鮮重。

1.5 生理指標(biāo)測(cè)定

超微弱發(fā)光的測(cè)定使用超微弱發(fā)光測(cè)試系統(tǒng)(BPCL-2-SH)，共測(cè)5次，減去本底取平均值，即為沙蔥種子的最終發(fā)光強(qiáng)度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用 Microsoft Excel 2007 軟件作圖，差異顯著性用Duncan’s檢驗(yàn)，SPSS 17.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工老化對(duì)沙蔥種子萌發(fā)及活力的影響

由表1可知，沙蔥種子各萌發(fā)指標(biāo)隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低的趨勢(shì)。ck0的各發(fā)芽指標(biāo)顯著高于ck1、ck2、ck3、ck4，在老化35 h后，活力指數(shù)為1%，表明沙蔥種子幾乎失活。而Ce3+處理下，Ce3+1各發(fā)芽指標(biāo)值高于ck1，平均發(fā)芽率比ck1高4%，活力指數(shù)比ck1高0.042，平均胚根長(zhǎng)比ck1長(zhǎng)1.64 cm。表明Ce3+有助于提高老化初期沙蔥種子活力及促進(jìn)胚根的伸長(zhǎng)。

2.2 人工老化對(duì)沙蔥種子相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由圖1可知，沙蔥種子相對(duì)電導(dǎo)率隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增大后減小再增大的趨勢(shì)，但各處理間差異不顯著，其中ck1相對(duì)電導(dǎo)率高于其他處理，表明種子隨老化脅迫種子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，內(nèi)部物質(zhì)外滲。而Ce3+處理，電導(dǎo)率隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)呈先減小再增大的趨勢(shì)；在老化處理5 h之前，Ce3+處理后的電導(dǎo)率值低于ck，隨后老化脅迫作用大于Ce3+處理作用，種子相對(duì)電導(dǎo)率隨對(duì)照逐漸升高。表明在老化程度較低的情況下，Ce3+前處理對(duì)沙蔥種子電解質(zhì)外滲有一定緩解作用。

處理發(fā)芽勢(shì)/%發(fā)芽率/%發(fā)芽指數(shù)活力指數(shù)鮮重/g胚根長(zhǎng)/cmck048+1.2a87+0.5a0.987+0.52a0.760+0.02a0.770+0.08a10.93+1.39ack115+3.2b58+1.0b0.547+0.28b0.205+0.05b0.375+0.01b9.03+0.58abck20c29+0.5c0.157+0.07c0.043+0.01c0.275+0.02c7.80+0.79bcck30c18+1.0d0.080+0.04d0.017+0.01d0.215+0.02cd6.87+1.27cck40c3+0.5e0.004+0.01e0.010+0.01e0.185+0.01d3.23+0.32dCe3+037+1.1a90+1.0a0.963+0.50a0.862+0.02a0.895+0.11a10.13+0.96aCe3+111+2.4b62+1.0b0.536+0.27b0.247+0.06b0.460+0.01b10.67+1.01aCe3+20c29+1.5c0.169+0.08c0.046+0.01c0.270+0.01c7.60+1.15bCe3+30c14+1.1d0.060+0.03d0.016+0.01d0.265+0.01c5.80+0.44cCe3+40c6+0.3e0.023+0.01e0.005+0.01e0.230±0.01c3.80+0.52d

圖1 人工老化過程中沙蔥種子相對(duì)電導(dǎo)率變化

2.3 人工老化對(duì)沙蔥種子呼吸速率的影響

由圖2可知，沙蔥種子呼吸速率隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增大后減小的趨勢(shì)，ck1呼吸速率最大，為0.12μmol·(g·min)-1，顯著高于其他處理。Ce3+處理組與ck有相似趨勢(shì)，Ce3+1處理呼吸速率最大。在老化15 h之前，Ce3+處理結(jié)果低于ck，在老化處理15 h之后，Ce3+處理結(jié)果又高于ck。在老化5 h到15 h時(shí)，呼吸速率降低的最快，表明在此階段物質(zhì)消耗最多。

圖2 人工老化過程中沙蔥種子呼吸速率變化

2.4 人工老化對(duì)沙蔥種子活性氧的影響

圖3 人工老化過程中沙蔥種子超氧陰離子產(chǎn)生速率的變化

圖4 人工老化過程中沙蔥種子過氧化氫含量的變化

2.5 人工老化對(duì)沙蔥種子超微弱發(fā)光的影響

由圖5可知，沙蔥種子超微弱發(fā)光強(qiáng)度隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸降低的趨勢(shì)，各處理間差異顯著，ck2、ck3和ck4比ck0分別降低了30%、37.3%和73.3%。

表2 沙蔥種子活力與部分生理指標(biāo)間的相關(guān)性

處理GPGRGIVIFWRLECRRO·-2H2O2UWLGP10.926*0.971**0.997**0.990**0.7670.6380.6660.4940.2830.726GR0.924*10.987**0.916*0.943*0.931*0.6670.885*0.7850.5810.923*GI0.968**0.990**10.959**0.971**0.8660.7060.8240.6830.4660.853VI0.999**0.923*0.965**10.995**0.7670.5760.6330.4730.2570.714FW0.998**0.940*0.977**0.998**10.8210.5560.6820.5460.3210.769RL0.6860.910*0.8430.6860.72210.4600.882*0.879*0.7730.986**EC-0.167-0.467-0.375-0.142-0.203-0.72410.7340.5140.4130.554RR0.7500.937*0.885*0.7460.7830.989**-0.72110.955*0.8100.943*O·-20.4490.6860.5990.4610.5020.868-0.6630.85210.8760.934*H2O20.4210.6880.5930.4310.4740.895*-0.7250.8700.993**10.837UWL0.6220.8490.7730.6300.6670.970**-0.6800.956*0.959**0.967**1

注：GP為發(fā)芽勢(shì)；GR為發(fā)芽率； GI為發(fā)芽指數(shù)；VI為活力指數(shù)；FW為鮮重；RL為胚根長(zhǎng)；EC為電導(dǎo)率；RR為呼吸速率。*表示在0.05水平顯著相關(guān)；**表示在0.01水平極顯著相關(guān)。

在Ce3+處理組中，Ce3+比ck的超微弱發(fā)光強(qiáng)度高，Ce3+1和Ce3+0的超微弱發(fā)光強(qiáng)度差異不顯著，Ce3+0顯著高于Ce3+2、Ce3+3和Ce3+4的超微弱發(fā)光強(qiáng)度，Ce3+2、Ce3+3和Ce3+4比Ce3+0分別降低了18.4%、32%和68%。

圖5 人工老化過程中沙蔥種子超微弱發(fā)光的變化

2.6 相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 人工老化對(duì)沙蔥種子活性氧的影響

3.2 人工老化對(duì)沙蔥種子超微弱發(fā)光的影響

超微弱發(fā)光( Ultraweak luminescence，UWL)檢測(cè)技術(shù)可以在不破壞生物體時(shí)探究生物體生理信息，研究發(fā)現(xiàn)超微弱發(fā)光與生物機(jī)體的氧化代謝、細(xì)胞分裂和死亡、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信息傳遞以及生長(zhǎng)過程等有著密切的聯(lián)系[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，小麥種子隨著老化程度的加深，超微弱發(fā)光強(qiáng)度逐漸降低[21-22]。在ck處理組，超微弱發(fā)光與發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)。這與張文蘭等[23]的研究結(jié)果一致。而龐靖祥等研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根種子的發(fā)芽率與其自發(fā)發(fā)光的強(qiáng)度是負(fù)相關(guān)的[24]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在ck 處理組，超微弱發(fā)光強(qiáng)度與相對(duì)電導(dǎo)率呈正相關(guān)，在Ce3+處理組，兩者呈負(fù)相關(guān)。這與田茜等[25]的研究結(jié)果一致，表明Ce3+有效作用細(xì)胞的生物膜系統(tǒng)，有效的緩解了細(xì)胞膜的破壞和種子內(nèi)含物外滲。

圖6 蘋果酸調(diào)控植物程序性細(xì)胞死亡模式圖

綜上所述，在種子的加速老化過程中，超微弱發(fā)光強(qiáng)度與活性氧、呼吸作用、發(fā)芽指標(biāo)等生理指標(biāo)有一定相關(guān)性，Ce3+處理可調(diào)控活性氧的增加，減緩老化對(duì)細(xì)胞損傷，維持各項(xiàng)功能穩(wěn)定性。超微弱發(fā)光強(qiáng)度與活性氧呈極顯著相關(guān)，表明超微弱發(fā)光強(qiáng)度隨活性氧的變化而變化，與生物化學(xué)提出的“活性氧”機(jī)制相一致。然而，Ce3+是如何調(diào)控活性氧迸發(fā)，緩解沙蔥種子老化，以及在生物變化的某個(gè)過程或影響生物某個(gè)代謝循環(huán)需要進(jìn)行深入的分析；另外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在老化5 h是Ce3+處理和ck在相對(duì)電導(dǎo)率高低的分界點(diǎn)，細(xì)胞受脅迫的程度可通過測(cè)定細(xì)胞電解質(zhì)滲出率反應(yīng), 電導(dǎo)率數(shù)值的大小反應(yīng)細(xì)胞膜透性的變化, 兩者的變化趨勢(shì)一[26]，因此將在接下來的細(xì)胞膜透性試驗(yàn)中驗(yàn)證。相關(guān)系數(shù)分析得出超微弱發(fā)光與超氧陰離子產(chǎn)生速率和過氧化氫含量呈極顯著正相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)線粒體組分參與PCD表明線粒體也能觸發(fā)和執(zhí)行PCD過程，ROS可以充當(dāng)誘導(dǎo)PCD的信號(hào)分子，改變線粒體膜通透性，細(xì)胞色素C和線粒體電子傳遞鏈(mETC)崩解釋放的ROS足以促使PCD的發(fā)生達(dá)到致死水平[27]?？杉傧敕N子老化過程ROS的產(chǎn)生可誘導(dǎo)種子PCD(圖6),又UWL相關(guān)ROS，推測(cè)在細(xì)胞外UWL反映PCD形態(tài)特征，在細(xì)胞內(nèi)ROS反映PCD生理特征。在擬南芥中, 葉綠體中生成的蘋果酸通過DiT 1運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)，繼而被某個(gè)/某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。蘋果酸在線粒體中被mMDH 1催化形成草酰乙酸，并伴隨著NADH的積累，為線粒體膜上的mETC復(fù)合體提供電子，產(chǎn)生ROS，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)生程序性細(xì)胞死亡[28]。