自噬促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠INS-1胰島β細(xì)胞凋亡

宋 峰，王 瑾，王 麗，焦向英

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1. 生理學(xué)系、2. 病理學(xué)教研室，山西 太原 030001)

“炎癥學(xué)說(shuō)”作為糖尿病發(fā)病的重要學(xué)說(shuō)之一近年來(lái)已得到國(guó)內(nèi)外專家的普遍認(rèn)可。研究表明，糖尿病患者血清中含有多種炎癥因子，已知這些炎性因子可通過(guò)多種方式導(dǎo)致胰島β細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷、功能障礙，隨之引起胰島素分泌不足，難以支撐正常的生物學(xué)功能，其中包含白介素-1β(interleukin，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor -ɑ，TNF-ɑ)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等[1, 2]。IL-1β是一種以單核-巨噬細(xì)胞為主的一系列細(xì)胞分泌并合成的強(qiáng)力炎性細(xì)胞因子[3, 4]。正常情況下，IL-1β不表達(dá)，但病理?xiàng)l件下，如動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和糖尿病時(shí)其表達(dá)升高。已有研究證實(shí)，IL-1β可促進(jìn)胰島β細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病發(fā)生發(fā)展[5]，但是炎性因子IL-1β誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制目前仍不明確。

細(xì)胞自噬是指細(xì)胞利用溶酶體將細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器進(jìn)行降解并回收利用，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞在不利環(huán)境下得以生存并保持健康狀態(tài)[6]。自噬在真核細(xì)胞中是一種非常普遍的現(xiàn)象。適度自噬能使靶細(xì)胞對(duì)外界損傷做出反應(yīng)，使其存活；同時(shí)也能將受損的細(xì)胞器清除，利于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持[6]；然而，有研究表明，過(guò)度激活的自噬可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，造成細(xì)胞損傷[7]。大量研究表明，糖尿病發(fā)生時(shí)胰島組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)升高，那么IL-1β作為糖尿病及其并發(fā)癥時(shí)存在的一種重要炎性細(xì)胞因子，是否可以通過(guò)誘導(dǎo)自噬發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡呢？本研究擬探討IL-1β誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生過(guò)程中自噬是否發(fā)揮重要作用，從而為糖尿病的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料INS-1細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所-協(xié)和細(xì)胞庫(kù))；IL-1β(Peprotech公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(北京賽澳美細(xì)胞有限公司)；抗LC3抗體(Sigma)；抗Beclin 1抗體(Abcam)；CCK-8試劑盒(武漢索萊寶)；抗cleaved-caspase-3抗體和caspase-3抗體(美國(guó)CST公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)；3-甲基腺嘌呤(3-MA)(Sigma)；雷帕霉素(rapamycin，RAPA) (美國(guó)MedChem Express)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 將INS-1細(xì)胞分為對(duì)照組(IL-1β 0 mol·L-1)和IL-1β處理組(IL-1β 10-9、10-8、10-7mol·L-1)共4組。

1.2.2細(xì)胞存活率檢測(cè) 收集處于對(duì)數(shù)期長(zhǎng)勢(shì)良好的INS-1細(xì)胞，調(diào)整加入培養(yǎng)基的量使得加入96孔板里的細(xì)胞密度維持在約5 000/孔，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，待貼壁后加入不同濃度的IL-1β(10-9、10-8、10-7mol·L-1)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，觀察不同濃度的IL-1β 處理對(duì)INS-1胰島β細(xì)胞的影響。5% CO2，37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞24 h，隨后每孔加入10 μL CCK-8檢測(cè)用液，在細(xì)胞培孵育箱內(nèi)再培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)檢測(cè)其450 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度。分別處理不同時(shí)間(0、6、12、24、48 h)，然后與上述同樣步驟在450 nm處測(cè)定其吸光度。細(xì)胞存活率/%=[(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對(duì)照孔-空白孔)]×100%

1.2.3Western blot檢測(cè)凋亡、自噬 細(xì)胞分2部分進(jìn)行處理：一部分在INS-1細(xì)胞中分別加入0、10-9、10-8、10-7mol·L-1的IL-1β培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞；另一部分先用RAPA(5×10-6mol·L-1)或者3-MA(10-5mol·L-1)預(yù)處理細(xì)胞1 h，隨后加入10-8mol·L-1的IL-1β在37 ℃培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、caspase-3，以及自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin 1、P62的表達(dá)。收集細(xì)胞于EP管中，加入101 μL 混合液(100 μL RIPA裂解液和1 μL的苯甲基磺酰氟PMSF)吹散細(xì)胞，超聲波碎裂細(xì)胞，4 ℃放置2～3 h，12 000 rpm離心15min，取上清。BCA法測(cè)蛋白濃度，選擇40 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，封閉用5% BSA、2 h，TBST洗膜3次之后一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日回收一抗，洗滌后二抗孵育2 h，用ECL超靈敏發(fā)光液進(jìn)行曝光。所得條帶用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將待測(cè)細(xì)胞用胰酶消化下來(lái)，10 mL管收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，放入玻璃管中離心1 000 rpm，5 min。再加入1 mL PBS，混合為細(xì)胞懸液，用濾過(guò)膜過(guò)濾，收集于流式玻璃管中，沖洗2次， 800 rpm離心5min。加入200 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)混勻。室溫下避光靜置15 min，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡率/%=細(xì)胞凋亡數(shù)/細(xì)胞總量×100%。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β導(dǎo)致大鼠INS-1胰島β細(xì)胞的存活率下降，且呈濃度及時(shí)間依賴性與對(duì)照組(0 mol·L-1)相比，隨著IL-1β濃度的升高，INS-1細(xì)胞存活率逐漸下降，在10-8mol·L-1時(shí)下降顯著[(78.25±1.97)%,P<0.01](Fig 1A)；使用10-8mol·L-1IL-1β分別以6、12、24、48 h不同時(shí)長(zhǎng)培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，與0 h相比，IL-1β作用24 h時(shí)細(xì)胞活力顯著下降[(77.98±0.97)%,P<0.01](Fig 1B)。以上結(jié)果提示，采用IL-1β處理胰島β細(xì)胞可以引起細(xì)胞存活率呈濃度和時(shí)間依賴性下降(Fig 1)。

2.2 IL-1β可以濃度及時(shí)間依賴性促進(jìn)INS-1細(xì)胞凋亡Western blot結(jié)果顯示，隨著IL-1β濃度的增加，cleaved caspase-3/caspase-3比值不斷增加 (Fig 2A)。進(jìn)一步采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)觀察IL-1β干預(yù)不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)INS-1胰島β細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示:與對(duì)照組(3.01±0.89)%相比，12 h細(xì)胞凋亡比率(12.12±1.18)%明顯升高(P<0.01)，36 h細(xì)胞凋亡率達(dá)到(22.32±1.30)%，明顯高于對(duì)照組(P<0.01)(Fig 2B)。提示，IL-1β可以誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡增加。

Fig 1 Viability of INS-1 cells decreased by IL-1β in a concentration-and time-dependent

A:INS-1 cells were pretreated with IL-1β at different concentrations, and survival rates were measured by CCK-8 assay. B:INS-1 cells were treated with IL-1β (10-8mol·L-1),and the survival rate were measured at different time points.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.3 IL-1β可濃度依賴性的上調(diào)INS-1細(xì)胞自噬水平使用不同濃度(0、10-9、10-8、10-7mol·L-1)的IL-1β處理INS-1細(xì)胞24 h，用Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1、P62的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著IL-1β處理濃度的不斷增大，LC3和Beclin1蛋白水平不斷增加(P<0.05，P<0.01)，而P62蛋白表達(dá)則逐漸下降(P<0.01)(Fig 3)。提示，IL-1β可以誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞自噬增加。

2.4 雷帕霉素上調(diào)自噬可增加IL-1β誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)增加使用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(RAPA)預(yù)處理細(xì)胞1 h后，再給予10-8mol·L-1的IL-1β培養(yǎng)24 h，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果顯示，RAPA預(yù)處理組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3和 Beclin 1的水平明顯高于IL-1β組(P<0.01)，P62水平明顯低于IL-1β組(P<0.01)，證明RAPA可以上調(diào)INS-1細(xì)胞自噬。檢測(cè)凋亡水平發(fā)現(xiàn)，與IL-1β組相比，用RAPA預(yù)處理細(xì)胞后，cleaved caspase-3/caspase-3比值明顯增加(P<0.05)，提示RAPA可以通過(guò)上調(diào)自噬進(jìn)一步增加IL-1β誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡(Fig 4)。

Fig 2 Apoptosis of INS-1 cells promoted by

A:Detection of apoptosis in INS-1 cells incubated with different concentrations of IL-1β by Western blot.**P<0.01vscontrol group. B:Detection of apoptotic ratio in INS-1 cells incubated with IL-1β at different time by flow cytometry.**P<0.01vscontrol group.

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.5 3-MA下調(diào)自噬可逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡水平增加3-Methyladenine(3-MA)是常用自噬抑制劑。采用3-MA預(yù)處理細(xì)胞1 h后，再給予IL-1β(10-8mol·L-1)培養(yǎng)24 h，Western blot檢測(cè)細(xì)胞自噬和凋亡水平。Western blot 結(jié)果顯示，3-MA預(yù)處理組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin 1的水平明顯低于IL-1β組(P<0.01)，P62水平明顯高于IL-1β組(P<0.01)，證明3-MA可以下調(diào)自噬。接著檢測(cè)凋亡水平發(fā)現(xiàn)，與IL-1β組相比，用3-MA預(yù)處理細(xì)胞后，cleaved caspase-3/caspase-3比值下降(P<0.05)，提示3-MA抑制自噬可減少I(mǎi)L-1β誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡(Fig 5)。

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查表明，2型糖尿病的發(fā)病率已達(dá)到223～345/萬(wàn)人[8]，但糖尿病的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。近年來(lái)眾多研究者對(duì)糖尿病的“炎癥學(xué)說(shuō)”[1]頗為認(rèn)可。在2型糖尿病的發(fā)病過(guò)程中，當(dāng)胰島β細(xì)胞功能衰竭時(shí)，可以誘導(dǎo)TNF-ɑ、IL-1β等炎癥因子的富集，進(jìn)而造成胰島β細(xì)胞的損傷。生理情況下細(xì)胞內(nèi)的IL-1β是無(wú)活性的，當(dāng)受到刺激引發(fā)炎癥時(shí)，IL-1β剪切為有活性的IL-1β分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用[2]。在炎癥發(fā)生過(guò)程中，IL-1β可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，破壞胰島β細(xì)胞膜的完整，進(jìn)而減少胰島素分泌，降低胰島素受體的敏感性[9-10]，但I(xiàn)L-1β對(duì)于胰島細(xì)胞損傷的作用及可能原因尚不清楚。本研究首先證明IL-1β可以降低INS-1細(xì)胞的存活率，同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot方法檢測(cè)了IL-1β對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)IL-1β可以濃度和時(shí)間依賴性的促進(jìn)INS-1細(xì)胞凋亡，從而明確了IL-1β具有誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡和細(xì)胞損傷的作用。但I(xiàn)L-1β誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確。

Fig 4 Apoptosis of INS-1 cells induced by IL-1β was increased by up-regulation of

A:RAPA induced the expression of autophagy-associated proteins. B:Apoptosis was promoted by RAPA.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIL-1β group.

Fig 5 Apoptosis of INS-1 cells induced by IL-1β was reduced by down-regulation of

A:3-MA inhibited the expression of autophagy-associated proteins. B:Apoptosis was inhibited by 3-MA.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIL-1β group.

自噬是細(xì)胞將自身受損的細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)包被形成囊泡，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，通過(guò)降解其所包裹的內(nèi)容物來(lái)發(fā)揮作用。自噬的作用尚存爭(zhēng)議。有研究表明，自噬可以調(diào)控胰島素信號(hào)途徑，產(chǎn)生胰島素抵抗的主要原因是自噬水平的降低，通過(guò)對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)控來(lái)預(yù)防胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的損傷對(duì)于治療糖尿病有重要的意義[12]。但是，亦有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)度的自噬又可能對(duì)細(xì)胞造成損傷[13]。然而，自噬是否直接參與2型糖尿病的產(chǎn)生和后續(xù)發(fā)展及其具體的機(jī)制尚不清楚。LC3、Beclin 1和p62是細(xì)胞自噬的標(biāo)志性蛋白。自噬形成時(shí)，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば?即LC3-Ⅱ)，自噬的程度可用LC3-II/LC3-I比值評(píng)價(jià)；Beclin 1是哺乳類動(dòng)物參與自噬的特異性基因；P62是自噬選擇性底物，P62消耗越多即水平越低提示自噬水平越高[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL-1β可以濃度依賴性的增加LC3、Beclin 1的表達(dá)，降低P62的表達(dá)，提示IL-1β可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞自噬的發(fā)生。為進(jìn)一步研究自噬在IL-1β誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡發(fā)揮的作用情況，我們分別采用自噬激動(dòng)劑RAPA和自噬抑制劑3-MA預(yù)處理INS-1細(xì)胞上調(diào)或抑制自噬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)自噬IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)進(jìn)一步增加，抑制自噬IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的增加被逆轉(zhuǎn)。由此說(shuō)明自噬的增加可以促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的凋亡水平，下調(diào)自噬可以減輕IL-1β引起的INS-1胰島β細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，炎癥因子IL-1β可以促進(jìn)INS-1胰島β細(xì)胞的凋亡，這一作用可能是由IL-1β增加細(xì)胞自噬引起的。但是，IL-1β增加自噬水平的可能機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系、細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此感謝在實(shí)驗(yàn)中給予指導(dǎo)和幫助的各位老師和同學(xué)。)