白花丹醌對大鼠肝星狀細(xì)胞活性氧及TGF-β1/Smad信號通路的影響

王聲善，趙 川，陳永欣，唐愛存，彭 岳，劉雪梅，林宇寧，陳婉君，韋燕飛

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530023)

肝纖維化是由慢性肝病引起的，與肝硬化高發(fā)病率和高死亡率密切相關(guān)。慢性氧化應(yīng)激是啟動肝臟纖維化過程的重要病因。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是內(nèi)源性、肝臟特異性間充質(zhì)細(xì)胞，在肝臟炎癥和纖維化發(fā)生中起關(guān)鍵作用[1]。在正常肝臟中，HSC含有維生素A脂滴。通過肝損傷激活，靜息HSC成為活化的HSC，其特征在于α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix，ECM)[2]。研究表明，氧化應(yīng)激可以刺激HSC的活化，其中活性氧(reactive oxygen species，ROS)與HSC激活密切相關(guān)。ROS是由各種肝臟損傷產(chǎn)生的，如酒精濫用、肝炎病毒感染和慢性膽汁淤積，并有助于肝纖維化[3]。ROS可刺激膠原蛋白I的產(chǎn)生，是轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和Smad作用于肝纖維化的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)介質(zhì)[4]。由于HSC在ECM形成中的重要作用，HSC的活化被認(rèn)為是肝纖維化的重要部分。TGF-β1是引起ROS產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子，可通過激活其下游Smad信號通路，刺激HSC的激活和增殖[5]。因此，TGF-β1/Smad信號被認(rèn)為是預(yù)防和治療肝纖維化的潛在靶標(biāo)。

白花丹(PlumbagozeylanicaL)別名為“白雪花”“三錢三”或“猛老虎”，白花丹有效成分為白花丹醌(plumbagin)。眾多研究結(jié)果表明，白花丹醌具有抗炎、抗菌、抗氧化應(yīng)激、抗肝纖維化、抗腫瘤等藥理學(xué)作用[6-8]。然而，白花丹醌對肝纖維化的作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)原代HSC，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)，觀察白花丹醌對原代HSC的影響，檢測其對ROS表達(dá)及TGF-β1/Smad信號的影響，探討白花丹醌的潛在抗肝纖維化機(jī)制，為民族醫(yī)藥深入開發(fā)利用及其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SD大鼠，體質(zhì)量(140～180) g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)批號：SCXK-Gui-2014-0002。

1.2 藥物與試劑白花丹醌(Sigma公司，批號：20071028)；0.25%胰酶(Gibco公司，批號：15050065)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0010)、磷酸酶抑制劑(批號：S1873)，均購自碧云天公司；兔多抗p-Smad2/3(CST公司，批號：8828)；兔單抗Smad2/3(Abcam公司，批號：Ab202445)；兔多抗Smad7(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1399)；DCFH-DA(批號：S0033)、DAPI(批號：C1002)，均購自碧云天公司；Collagen III抗體(三鷹公司，批號：22734-1-AP)；TGF-β1(Peprotech公司，貨號：100-21)。

1.3 儀器IX51倒置顯微鏡(Olympus公司)；MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀(Thermo公司)；DYCZ-24DN垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；HI650離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；T8-1磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器廠)。

2 方法

2.1 原代大鼠HSC的分離與培養(yǎng)大鼠以戊巴比妥鈉麻醉，同時皮下注射5 000 U肝素鈉抗凝；皮膚常規(guī)消毒后打開腹腔，鈍性分離門靜脈及下腔靜脈；以16號套管針作門靜脈插管，37 ℃灌注D-Hanks液，10 mL·min-1至肝臟充盈，剪開下腔靜脈放血后結(jié)扎。立即打開胸腔，以16號套管針作上腔靜脈插管，形成門靜脈-上腔靜脈循環(huán)；以0.1%鏈霉蛋白酶E 5 mL·min-1灌注3～4 min，0.03%Ⅱ型膠原酶5 mL·min-1灌注3～4 min；取出肝臟，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入鏈霉蛋白酶E至終濃度為0.006%、DNA酶至終濃度為10 pug/mL。37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)消化30 min；過200目篩網(wǎng)，培養(yǎng)液洗4次，將細(xì)胞鋪于制備好梯度的細(xì)胞分離管中，對照管中加入等量培養(yǎng)液;4 ℃、800×g平拋離心30 min。吸取1.040密度層的上層細(xì)胞，培養(yǎng)液洗2次，加入無血清RPMI l640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2孵箱孵育15 min，吸取細(xì)胞懸液，在6孔板中以含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)。24 h后換液，此后每3 d換液1次[9]。

2.2 MTT法檢測HSC增殖情況經(jīng)過原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到3×104個接入96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別加入白花丹醌(1、2、4、8、16 μmol·L-1)，同時設(shè)空白組。37 ℃培養(yǎng)24 h；接著每孔加入10 μL MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h；吸出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO震蕩10 min。酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(OD568)，計算細(xì)胞活力抑制率。細(xì)胞活力抑制率/%=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值)×100%。

2.3 熒光探針法測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平取對數(shù)生長期細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到3×104個接種于96孔板，每組3個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照組，每孔100 μL細(xì)胞懸液，同時設(shè)空白組，37 ℃培養(yǎng)過夜；按分組更換100 μL含白花丹醌(2、4、8 μmol·L-1完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h；每孔更換終濃度為10 μmol·L-1DCFH-DA的無血清DMEM培養(yǎng)基100 μL，37 ℃培養(yǎng)20 min；無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次；熒光酶標(biāo)儀檢測(激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm)。

2.4 Western blot檢測Smad蛋白表達(dá)制備裂解液，低溫提取總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組蛋白濃度；將提取的蛋白上清與5×蛋白上樣緩沖液放入沸水中，沸水浴10 min；制備5%濃縮膠和12%分離膠，上樣后電泳分離，電轉(zhuǎn)移120 min，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h，磷酸化蛋白用1%～3%的BSA封閉。一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5～6次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記二抗(1 ∶50 000稀釋)，37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗膜5～6次，每次5 min。將ECL工作液滴加于PVDF膜上，X線膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

3 結(jié)果

3.1 原代大鼠HSC形態(tài)變化倒置顯微鏡下觀察大鼠HSC，在分離后d 1，HSC開始貼壁，細(xì)胞呈卵圓形狀態(tài)，胞體變大、變平；細(xì)胞呈散在分布，可見單核或雙核肝細(xì)胞；分離后d 3，細(xì)胞全部貼壁，胞質(zhì)中脂滴減少、逐漸消失，HSC形態(tài)多樣，部分細(xì)胞已出現(xiàn)多角偽足，呈星狀；分離后d 5，HSC呈現(xiàn)不規(guī)則多角形，相鄰HSC連接更加緊密，形成島狀或條索狀；細(xì)胞呈對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖速度增加，呈梭形；分離后d 8，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板，細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)轭惱w維狀(Fig 1)。

3.2 免疫熒光法鑒定HSC中α-SMA的表達(dá)通過觀察典型的HSC形態(tài)變化，分離的原代細(xì)胞活化后，經(jīng)α-SMA免疫組織熒光鑒定，呈陽性表達(dá)，陽性率達(dá)91%,獲得了高純度的大鼠原代HSC(Fig 2)。

3.3 白花丹醌對HSC增殖的抑制作用MTT結(jié)果顯示(Tab 1)，白花丹醌2～16 μmol·L-1對細(xì)胞活力的抑制率明顯，且抑制率隨濃度的增加而提高。為避免高濃度白花丹醌對細(xì)胞毒性的未知影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇白花丹醌2、4、8 μmol·L-1作為實(shí)驗(yàn)濃度。

GroupConcentration/μmol·L-1OD(24 h)Inhibitoryrate/%Control-0.388±0.021-Plumbagin10.381±0.021220.329±0.016?1540.186±0.013??5280.129±0.009??67160.059±0.011??85

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.4 白花丹醌對HSC形態(tài)的影響如Fig 3所示，正常的HSC隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，數(shù)量不斷擴(kuò)增，細(xì)胞形態(tài)由原來的星狀結(jié)構(gòu)變?yōu)榧±w維狀。從細(xì)胞的形態(tài)來看，與空白組比較，TGF-β1組越來越多細(xì)胞更接近于肌纖維狀；與TGF-β1組比較，NADPH氧化酶抑制劑DPI及白花丹醌各濃度組可以抑制HSC向肌纖維狀變化，保持HSC的星狀結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞更長時間處于靜息狀態(tài)。

3.5 白花丹醌對HSC內(nèi)ROS水平的影響熒光探針法檢測結(jié)果顯示(Fig 4)，與空白對照組相比，模型組HSC內(nèi)綠色熒光明顯增強(qiáng)，表明ROS水平明顯升高。與模型組相比，給藥組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光信號明顯減弱，DPI組和白花丹醌各濃度組可不同程度下調(diào)ROS的水平，隨著白花丹醌濃度的增加，HSC內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯減弱，且綠色熒光的細(xì)胞數(shù)明顯減少。另外，與模型組相比，DPI組和白花丹醌組ROS熒光密度值明顯降低，與正常組比較，差異無顯著性。

Fig 1 Morphological changes of primary rat HSC(×400)

Fig 2 Immunofluorescence identification of α-SMA(×200)

Fig 3 Morphological observation of HSC(×200)

Fig 4 Effect of plumbagin on ROS production in HSC(×200)

Fig 5 Effect of plumbagin on α-SMA in HSC(×200)

3.6 白花丹醌對HSC中α-SMA和collagen III蛋白表達(dá)的影響如Fig 5所示，與對照組比較，TGF-β1刺激的HSC中α-SMA和collagen III呈現(xiàn)陽性表達(dá)，表明細(xì)胞造模成功。隨著白花丹醌濃度的增加，α-SMA和collagen III表達(dá)逐漸下調(diào)，DPI組與白花丹醌處理組中α-SMA和collagen III表達(dá)均降低。

3.7 白花丹醌對HSC中Smad蛋白表達(dá)的影響Fig 6的Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，TGF-β1刺激組中p-Smad2/3、Smad2/3表達(dá)升高，而Smad7表達(dá)降低；與TGF-β1組比較，DPI組及白花丹醌各濃度處理組中p-Smad2/3的表達(dá)降低，抑制其活性，但總Smad2/3無明顯變化；相反，DPI及白花丹醌各濃度處理組中，Smad7蛋白水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig 6 Effect of plumbagin on protein expression of Smad in HSC detected by Western

1:Control; 2:TGF-β1; 3:DPI; 4:Plumbagin 2 μmol·L-1; 5:Plumbagin 4 μmol·L-1; 6:Plumbagin 8 μmol·L-1.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1.

4 討論

肝纖維化在多種慢性肝病的發(fā)展階段常見，其特征在于肝臟內(nèi)ECM的過度沉積導(dǎo)致[10]?，F(xiàn)已證明，由NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)產(chǎn)生的ROS是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，介導(dǎo)了各種促肝纖維化因子的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明，ROS可直接刺激HSC的增殖與活化，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[11]。本研究結(jié)果顯示，HSC經(jīng)過白花丹醌(2～16 μmol·L-1)處理后，對細(xì)胞活力的抑制率高于10%，對TGF-β1刺激的活化型HSC的生長具有明顯的抑制作用。TGF-β1刺激的模型復(fù)制成功后，給予白花丹醌作用24 h后，HSC由肌纖維狀變?yōu)樾菭罱Y(jié)構(gòu)，使細(xì)胞由活化狀態(tài)轉(zhuǎn)為靜息狀態(tài)，對細(xì)胞的增殖有抑制作用；熒光探針法檢測結(jié)果顯示，白花丹醌藥物組可不同程度下調(diào)HSC中ROS水平，提示白花丹醌抑制HSC增殖和活化功能的機(jī)制之一可能與下調(diào)ROS等抗氧化功能有關(guān)。此外，α-SMA是HSC活化的標(biāo)志之一，白花丹醌可降低HSC中α-SMA蛋白表達(dá)，從而使HSC更多的處于靜息狀態(tài)。

TGF-β超家族是一組多功能多肽，包括TGF-β1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、抑制素和激活素。與肝硬化密切相關(guān)的TGF-β由5個成員組成，TGF-β1～TGF-β5，其中只有TGF-β1與肝纖維化相關(guān)[12]。TGF-β1廣泛存在于動物的正常組織和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，骨組織和血小板中含量最豐富[13]。它可以抑制增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和免疫抑制，促進(jìn)ECM合成，調(diào)節(jié)膠原蛋白的產(chǎn)生和組織修復(fù)。TGF-β1濃度在正常肝臟中較低，但在肝臟損傷發(fā)生時明顯增加。當(dāng)肝纖維化期間由各種致病因子誘導(dǎo)時，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血小板和其他遷移性炎癥細(xì)胞可釋放大量TGF-β1。此外，活化的HSC最終成為TGF-β1產(chǎn)生的主要來源，形成正反饋回路[14]。本研究體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，HSC可被TGF-β1激活，白花丹醌可抑制HSC中Smad信號通路的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞活化，減緩肝纖維化進(jìn)程。

TGF-β1/Smad信號通路由3部分組成：細(xì)胞外TGF-β1、膜結(jié)合TGF-β1受體和細(xì)胞內(nèi)Smad蛋白。存在至少5種不同類型的TGF-β1受體，其中TβR-I和TβR-II是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，其是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。TβR是包含跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，在沒有配體的情況下，它們?nèi)匀皇嵌垠w。一旦TGF-β1與其受體結(jié)合，即TβR-I和TβR-II激活，然后催化下游Smad分子上絲氨酸殘基的磷酸化。最后，磷酸化的Smad進(jìn)入細(xì)胞核，并調(diào)節(jié)與肝纖維化相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smad是I型受體中唯一已知的細(xì)胞內(nèi)底物。Smad家族蛋白包括至少9種Smad蛋白，即Smad 1～9，其分為受體激活的Smad(R-Smad)，共同途徑Smad(Co-Smad)和抑制性Smad(I-Smad)。R-Smad蛋白，如Smad2和Smad3，主要可促進(jìn)肝纖維化，而I-Smad如Smad7，可抑制或調(diào)節(jié)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并抑制肝纖維化。由于TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在肝纖維化中的重要作用，阻斷其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是預(yù)防和治療肝纖維化的潛在策略[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，白花丹醌下調(diào)Smad2/3和p-Smad2/3的表達(dá)，并上調(diào)Smad7的表達(dá)，從而抑制TGF-β1/Smad信號通路。

總之，白花丹醌是從白花丹中提取的有效抗纖維化成分。白花丹醌可以調(diào)節(jié)ROS的表達(dá)；在TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，白花丹醌也下調(diào)α-SMA、Smad2/3和p-Smad2/3的表達(dá)，上調(diào)Smad7的表達(dá)。提示白花丹醌可能通過降低ROS的產(chǎn)生，從而抑制HSC的活化。因此，白花丹醌是治療肝纖維化的潛在藥物。