檸檬苦素降解酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)

劉川海，朱平平

（中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410083）

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 IDE的分離純化

1.1.1 培養(yǎng)液的制備

將50 ml選擇性液體培養(yǎng)基放置于250 ml錐形瓶?jī)?nèi),121℃,進(jìn)行20 min的滅菌處理，把種子液接種于選擇性液體培養(yǎng)基內(nèi)。37℃,180 r/min搖床培養(yǎng),收集培養(yǎng)液，4℃,10 000 r/min，進(jìn)行30 min的離心處理,收集上清液,在此基礎(chǔ)上測(cè)定上清液的總酶活力與總朊飽和度。

1.2.2 飽和(NH4)2SO4沉淀

取離心后菌株的發(fā)酵上清液,在冰浴環(huán)境下,攪拌時(shí)加入飽和度不相同的固體(NH4)2SO4，4 ℃過(guò)夜沉淀后10 000 r/min，15 min離心,將沉淀用少量蒸餾水溶解,放在透析袋內(nèi)予以透析除鹽處理。

完成透析后,分別測(cè)定各飽和度及不同透析液的吳茱萸內(nèi)酯IDE活力與朊量,在此基礎(chǔ)上繪制出(NH4)2SO4沉淀峰值，并明確(NH4)2SO4沉淀的最適飽和度。

上清液以最適的(NH4)2SO4飽和度鹽析后,4℃靜置24小時(shí),10 000 r/min離心30 min,剔除上淸液,把沉淀用少量蒸餾水溶解,放在透析袋內(nèi)透析除鹽24 min,就能夠獲取經(jīng)初步純化的粗酶液,在4℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 [C6H10O5]n凝膠G-100凝膠過(guò)濾層析

[C6H10O5]n凝膠G-100凝膠柱(1.6厘米×50厘米)裝柱后,首先通過(guò)0.02 mmol、pH為4.0的C6H8O7緩沖液予以平衡處理,在此基礎(chǔ)上將通過(guò)(NH4)2SO4沉淀、透析脫鹽、濃縮后的粗酶液加到已預(yù)先被平衡過(guò)的凝膠柱內(nèi),同時(shí)用0.02 mmol、pH為4.0的C6H8O7緩沖液洗脫,流速1 ml/min,經(jīng)自動(dòng)部分收集器每5 ml收集一管,經(jīng)紫外檢測(cè)儀在280 nm波長(zhǎng)區(qū)間予以全面檢測(cè),跟蹤監(jiān)測(cè)朊飽和度;依附于洗脫曲線,分別收集各洗脫峰值,并測(cè)定不同洗脫峰的降解吳茱萸內(nèi)酯活性,明確具有降解吳茱萸內(nèi)酯活性的目標(biāo)峰并予以收集處理,合并后在4 ℃環(huán)境下透析,通過(guò)HO(CH2CH2O)nH濃縮至5 ml,在4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 二乙氨乙基離子交換層析

二乙氨乙基離子交換柱(26厘米×20厘米)裝好后,提前通過(guò)0.02 mol、pH為4.0的C6H8O7平衡緩沖液予以平衡處理,在此基礎(chǔ)上將通過(guò)[C6H10O5]n凝膠g-100凝膠柱收集的活性峰濃縮后的樣品上樣,先經(jīng)緩沖液洗脫至樣品完全吸附,在此基礎(chǔ)上經(jīng)0～1 mmol的NaCl溶液予以線性梯度洗脫,流速控制在2 ml/min。經(jīng)自動(dòng)部分收集裝置每5 ml收集一管,在280 nm波長(zhǎng)區(qū)間擇取紫外檢測(cè)儀予以檢測(cè),跟蹤監(jiān)測(cè)朊飽和度;依附于洗脫梯度曲線分別收集各洗脫峰系數(shù),在此基礎(chǔ)上測(cè)定不同洗脫峰的降解吳茱萸內(nèi)酯酶活性,明確具有降解吳茱萸內(nèi)酯酶活性的目標(biāo)峰并予以收集處理,完成合并后在4 ℃環(huán)境下透析濃縮,并在4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 降解吳茱萸內(nèi)酯酶純度鑒定與分子質(zhì)量測(cè)定

采用C12H25―OSO3Na凝膠電泳垂直板電泳法，鑒定酶的純度并測(cè)定其分子質(zhì)量。C12H25―OSO3Na凝膠電泳垂直板電泳采用12%的分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)、電流強(qiáng)度為15毫安,濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、電流強(qiáng)度為10毫安。電泳在3小時(shí)后停止,通過(guò)coomassie brilliant blueG-250予以染色,在脫色后實(shí)施拍照處理。

2 IDE酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.1 酶最適反應(yīng)溫度

分別選取25、30、35、40、45 ℃作為酶反應(yīng)的溫度,測(cè)定反應(yīng)結(jié)構(gòu)中的酶活力,以最高酶活力為100%。

2.2 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

分別取10 ml酶液于35、45、55 ℃下恒溫水浴中保溫,每30 min吸取酶液各1 ml。立即于冰水中冷卻,在此基礎(chǔ)上取樣測(cè)剩余酶活力,以最高酶活力為100%,繪制溫度-相對(duì)殘留酶活力曲線,進(jìn)入明確溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。

2.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

分別配制含終濃度為10.0 mmol/L的不同金屬離子，其中包括Cu2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3 結(jié)果

3.1 IDE的分離純化

3.1.1 (NH4)2SO4沉淀

分別在10%-90%的飽和度(NH4)2SO4將上清液沉淀后，測(cè)定其透析液的朊析出量,作(NH4)2SO4飽和度-朊析出量曲線，如圖1所示,在(NH4)2SO4的飽和度超過(guò)90%,上清液中的朊析出量達(dá)到極值；40%～80%飽和度區(qū)間,隨(NH4)2SO4的飽和度的提高而遞增：在(NH4)2SO4的飽和度超過(guò)80%狀態(tài)下,朊析出量并未出現(xiàn)明顯的提升。

圖1 (NH4)2SO4飽和度對(duì)朊析出量的影響

3.1.2 [C6H10O5]n凝膠G-100凝膠過(guò)濾柱層析

將經(jīng)(NH4)2SO4沉淀、透析脫鹽、濃縮后的朊樣品上[C6H10O5]n凝膠G-100凝膠過(guò)濾柱得到如圖2所示的洗脫曲線。如圖2所示,上清液經(jīng)凝膠過(guò)濾柱處理后,出現(xiàn)兩個(gè)較為突出的洗脫峰,同時(shí)合并相同峰的洗脫液,濃縮后測(cè)定不同峰朊含量與降解吳茱萸內(nèi)酯酶活性。結(jié)果表明,峰1中朊含量為0.02 mg/ml，降解吳茱萸內(nèi)酯酶活力為19.47 μg,峰2內(nèi)朊含量為0.0133 mg/ml,活性為375.54 μg,通過(guò)比較,峰2有降解吳茱萸內(nèi)酯活性。

3.2 二乙氨乙基柱層析

通過(guò)二乙氨乙基柱層析分離后,朊主要集中于9～42管,同時(shí)在第16、37管岀現(xiàn)兩個(gè)活性峰,其中第16管朊含量達(dá)到極值,超過(guò)0.8325 μg/ml;吳茱萸內(nèi)酯IDE主要集中在第7～26管,其中在第16管出現(xiàn)一個(gè)峰值。通過(guò)洗脫曲線可發(fā)現(xiàn),吳茱萸內(nèi)酯降解集中在7～26管被洗脫岀來(lái),和35～42管的雜朊分離。通過(guò)分析對(duì)比,將7～26管的收集液作為純化分離后的酶液,通過(guò)透析、濃縮后測(cè)定吳茱萸內(nèi)酯IDE活力為64.% U/μg。

圖2 粗朊通過(guò)[C6H10O5]n凝膠G-100純化

3.3 酶純化結(jié)果

發(fā)酵上清液經(jīng)(NH4)2SO4鹽析、[C6H10O5]n凝膠G-100層析、二乙氨乙基柱層析后,各純化流程后所獲取的酶的比活力、純化倍數(shù)與酶活力回收率的表現(xiàn)為：粗酶液在通過(guò)3個(gè)的分離純化操作后,酶的純化倍數(shù)為9.54倍,酶活力回收率0.92%,比活力為354.51 U/μg,純化效果顯著。

4 IDE酶學(xué)性質(zhì)的研究

4.1 溫度對(duì)酶活力的影響

在25～35 ℃的范圍內(nèi)，吳茱萸內(nèi)酯IDE相對(duì)酶活力依附于溫度的提升而增加；在溫度為35 ℃狀態(tài)下，該酶活力達(dá)到極值；而在35～45 ℃區(qū)間，依附于溫度的增加，酶活性出現(xiàn)了一定程度的衰減，不過(guò)其下降幅度相對(duì)緩慢。所以，35 ℃是該酶的最適反應(yīng)溫度。

4.2 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

該酶在35 ℃狀態(tài)下相對(duì)穩(wěn)定，酶活力有一定程度的改變。在45 ℃狀態(tài)下，依附于時(shí)間的增加，IDE活力逐漸衰減，50 min后其酶活力損失約20%，而處于55 ℃狀態(tài)下，依附于保存時(shí)間的增加，吳茱萸內(nèi)酯IDE活力迅速衰減，由此可證該IDE的耐熱性不佳。

4.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

Fe3+對(duì)酶活力的促進(jìn)作用相對(duì)顯著，Cu2+與Fe2+對(duì)酶活力無(wú)顯著影響，不過(guò)Ca2+與Zn2+對(duì)酶活力有明顯的抑制。

5 結(jié)論

綜上所述，此次研究通過(guò)(NH4)2SO4沉淀、透析、濃縮、 [C6H10O5]n凝膠 C-100凝膠過(guò)濾層析、二乙氨乙基柱層析對(duì)6號(hào)菌株在最佳發(fā)酵環(huán)境中培養(yǎng)所獲取發(fā)酵液中所產(chǎn)的吳茱萸內(nèi)酯IDE予以純化及特性硏究。在(NH4)2SO4的飽和度超過(guò)90%，上清液中的朊析出量達(dá)到極值；40%～80%飽和度區(qū)間，依附于(NH4)2SO4的飽和度的提高而遞增：在(NH4)2SO4的飽和度超過(guò)80%狀態(tài)下，朊析出量并未出現(xiàn)明顯的提升。該酶在35 ℃狀態(tài)下相對(duì)穩(wěn)定，酶活力有一定程度的改變。在45 ℃狀態(tài)下，依附于時(shí)間的增加，吳茱萸內(nèi)酯降解酶活力逐漸衰減，50 min后其酶活力損失約20%，而處于55 ℃狀態(tài)下，依附于保存時(shí)間的增加，吳茱萸內(nèi)酯降解酶活力迅速衰減,由此可證該吳茱萸內(nèi)酯降解酶的耐熱性不佳。Fe3+對(duì)酶活力的促進(jìn)作用相對(duì)顯著，Cu2+與Fe2+對(duì)酶活力無(wú)顯著影響，不過(guò)Ca2+與Zn2+對(duì)酶活力有明顯的抑制。通過(guò)C12H25―OSO3Na凝膠電泳，純化后吳茱萸內(nèi)酯IDE的分子量達(dá)到了電泳純，在35℃條件下吳茱萸內(nèi)酯IDE的熱穩(wěn)定性優(yōu)異。Fe3+能夠促進(jìn)吳茱萸內(nèi)酯IDE活性的提高，Ca2+與Zn2+對(duì)酶具有顯著的抑制作用。