危永芳，周碧蘭,2，吳沁璇，吳昭全，唐龍亮，周帥，黃曉珊,2＊

（1.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410219；2.長(zhǎng)沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410100）

白血病是一類造血干細(xì)胞異常增生性疾病，其死亡率高，是我國(guó)十大高發(fā)惡性腫瘤之一[1]。目前，化療是治療白血病的一種重要手段。Rosenberg等[2]研究表明，順鉑可作為白血病的治療藥物。順鉑通過(guò)作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]，目前廣泛用于臨床上各種腫瘤的治療。眾所周知，線粒體是作為細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，線粒體分裂與融合處于動(dòng)態(tài)平衡，這對(duì)于維持線粒體功能至關(guān)重要[4]。線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1（Drp1）是一種介導(dǎo)線粒體分裂的蛋白[5]，Drp1過(guò)表達(dá)可促使線粒體的分裂增多，導(dǎo)致線粒體碎片化。研究表明，線粒體分裂與融合動(dòng)態(tài)過(guò)程失衡可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白酶，凋亡過(guò)程中最重要的事件之一即是Caspase-3的活化。本文通過(guò)研究Drp1抑制劑Mdivi-1對(duì)順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞Caspase-3活化及細(xì)胞凋亡的影響，探討Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂在順鉑抗白血病作用中的影響，期望進(jìn)一步揭示線粒體動(dòng)態(tài)變化對(duì)白血病順鉑耐藥的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

L1210細(xì)胞株，購(gòu)自武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。

胎牛血清（FBS），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；順鉑，購(gòu)自北京四正柏公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Mdivi-1，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Caspase 3抗體（兔），購(gòu)自美國(guó)CST公司；臺(tái)盼藍(lán)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 L1210細(xì)胞培養(yǎng)

L1210細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS和1%雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)及傳代。

1.3 臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)細(xì)胞凋亡

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L1210細(xì)胞，調(diào)節(jié)至適當(dāng)細(xì)胞密度，接種于6孔板中，分為對(duì)照（正常）組、DDP（順鉑）處理組、2.5 μmol/L Mdivi-1+DDP處理組、5 μmol/L Mdivi-1+DDP處理組、10 μmol/L Mdivi-1+DDP處理組；Mdivi-1+DDP處理組先加入對(duì)應(yīng)終濃度的Mdivi-1預(yù)處理l h，再加入DDP。給藥組加入終濃度為0.4 mg/L的DDP，處理48 h；收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混合均勻（臺(tái)盼藍(lán)終濃度為0.04%），靜置3 min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并計(jì)數(shù)，其中被染成淡藍(lán)色的為死細(xì)胞，無(wú)色透明狀細(xì)胞則為活細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞死亡率。

1.4 Western Blot檢測(cè)Caspase-3的活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L1210細(xì)胞，分為對(duì)照組和不同濃度（0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L、4.00 mg/L、8.00 mg/L和16.00 mg/L）順鉑處理組，分別用對(duì)應(yīng)濃度的順鉑處理48 h；另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L1210細(xì)胞分為對(duì)照（正常）組、DDP（順鉑）處理組、2.5 μmol/L Mdivi1+DDP處理組、5 μmol/L Mdivi1+DDP處理組、10 μmol/L Mdivi1+DDP處理組；Mdivi-1+DDP處理組先加入對(duì)應(yīng)終濃度的Mdivi-1預(yù)處理l h，再加入DDP。DDP處理組加入終濃度為8 mg/L的DDP，處理48 h。收集細(xì)胞，提取總蛋白，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Caspase-3的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Drp1抑制劑Mdivi-1對(duì)順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用

臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DDP處理組L1210細(xì)胞凋亡明顯增多，而當(dāng)提前1 h分別用不同濃度的Mdivi-1預(yù)處理時(shí)后，再用順鉑處理，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，說(shuō)明Drp1抑制劑Mdivi-1能抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其中5 μmol/L Mdivi-1的抑制作用最強(qiáng)（圖1A和圖1B）。結(jié)果表明，Drp1參與了順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞凋亡。

圖1 Mdivi-1對(duì)順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞凋亡的影響（＊＊P＜0.01）

2.2 Drp1抑制劑Mdivi-1對(duì)順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞Caspase-3活化有抑制作用

Western Blot法對(duì)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的表達(dá)及活化情況檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)順鉑濃度大于4 mg/L時(shí)可檢測(cè)到明顯的caspase-3活化（圖2A）。8 mg/L DDP處理組Cleaved-caspase-3比例明顯增多，Mdivi-1預(yù)處理組Cleaved-caspase-3比例有所降低，以5 μmol/L的Mdivi-1作用最明顯（圖2B）。該結(jié)果提示Mdivi-1對(duì)順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞Caspase-3活化有明顯抑制作用，即Drp1參與了順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞Caspase-3活化。

圖2 Mdivi-1對(duì)順鉑誘導(dǎo)的L1210細(xì)胞Caspase-3活化的影響

3 討論

白血病作為國(guó)內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害著人類的健康，化療是其的重要治療手段之一。順鉑作為第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)用于癌癥治療的鉑類化合物，通過(guò)與DNA發(fā)生鏈內(nèi)或鏈間交聯(lián)反應(yīng)，從而干擾DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抗腫瘤作用，可用于白血病的治療。線粒體作為細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，為細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)提供能量，在正常情況下線粒體的分裂/融合保持著平衡，分裂蛋白表達(dá)增加，融合蛋白表達(dá)減少，可促使線粒體分裂，并通過(guò)線粒體凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。Caspase-3作為線粒體凋亡通路下游的一種關(guān)鍵酶，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究顯示，順鉑能誘導(dǎo)L1210細(xì)胞Caspase-3活化及細(xì)胞凋亡，而線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1（Drp1）的抑制劑Mdivi-1對(duì)順鉑誘導(dǎo)的Caspase-3活化和細(xì)胞凋亡有顯著抑制作用（圖1、2）。Drp1是一種介導(dǎo)線粒體分裂的蛋白，Drp1過(guò)表達(dá)可促使線粒體的分裂增多，導(dǎo)致線粒體碎片化。Frank等[8]研究表明，在凋亡誘導(dǎo)前抑制Drp1的活性不僅能減少線粒體分裂，還能延緩Caspase-3的活化及細(xì)胞死亡過(guò)程。

上述結(jié)果提示Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂參與了順鉑抗白血病作用。然而順鉑與其他化療藥物相似，易產(chǎn)生耐藥性。Santin等[9]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體動(dòng)態(tài)變化與順鉑獲得性耐藥的產(chǎn)生有關(guān)。結(jié)合本研究的結(jié)果，期望進(jìn)一步揭示線粒體動(dòng)態(tài)變化對(duì)白血病順鉑耐藥的影響及機(jī)制。