陳碧霄、周 帆、楊 淼、朱 南、紀(jì)晗旭、張 露、喬 玲、楊 洋、祝晨辰、劉艷容、楊婷婷、杜亞瓊、馮詩旸、張馳

通訊作者： 張馳

南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院 210019

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計劃項(xiàng)目2017QK038 南京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目KJ2017005

食品包裝紙是以紙漿及紙板為主要原料的包裝制品，需要滿足無毒，抗油、防水防潮，密封等要求，且符合食品包裝安全要求的用于包裝食品的紙。食品包裝紙因其與食品直接接觸，且其包裝物大部分都是直接入口的食品，所以食品包裝紙最基本的要求是必須符合食品衛(wèi)生的要求，其次根據(jù)食品包裝紙使用要求的不同,還必須達(dá)到相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

我國對于食品包裝用紙的衛(wèi)生要求，在GB11680-1989食品包裝用原紙衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了食品包裝用紙衛(wèi)生指標(biāo)重金屬、微生物大腸菌群及致病菌的限量【1】，而在GB3561-1989食品包裝用原紙衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法中指出，食品包裝用紙的風(fēng)險監(jiān)控致病菌包括沙門氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌和溶血性鏈球菌【2】。

在對食品包裝用紙的致病菌檢測過程中，溶血性鏈球菌檢測方法中使用了CNA哥倫比亞血瓊脂平板，我們在檢測過程中發(fā)現(xiàn)在血瓊脂平板上出現(xiàn)具有溶血環(huán)，但菌落形態(tài)與溶血性鏈球菌菌落形態(tài)不同的菌落。因懷疑為致病菌，對其進(jìn)行分離鑒定，分離出2種生物形態(tài)近似，且均能產(chǎn)生溶血環(huán)的菌株，定為X1和X2，并分別對X1和X2進(jìn)行16S rRNA鑒定。

實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)儀器

DNA電泳槽DYCP-31DN，北京六一儀器廠；穩(wěn)壓電泳儀DYY-5，北京六一儀器廠；電熱恒溫水槽 DK-8D，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像儀 FR980，上海復(fù)日科技儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 DHP-9162，太倉市科教器材廠；恒溫?fù)u床 TH2-C，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；PCR 儀 Applied Biosystems2720， thermal cycler；冷凍高速離心機(jī)HC-2518R，BBI ；Surf 系列精密單道可調(diào)移液器SP10-1000，上海生工生物工程有限公司。

實(shí)驗(yàn)試劑

Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒SK8255，上海生工生物工程有限公司；Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒SK8259 ，上海生工生物工程有限公司；Ezup 柱式酵母基因組 DNA 抽提試劑盒SK8257 ，上海生工生物工程有限公司；DreamTaq-TM DNA Polymerase EP0702，MBI；dNTP D0056，上海生工生物工程有限公司；瓊脂糖 AB0014， BBI；SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒 SK8131，上海生工生物工程有限公司；DNA Ladder Mix maker SM0337，上海生工生物工程有限公司；pMD 18-T Vector連接試劑盒 D101A，Takara； SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒 SK8191，上海生工生物工程有限公司；槍頭、 PCR管、離心管等，上海生工生物工程有限公司

實(shí)驗(yàn)方法

16S rRNA的擴(kuò)增及序列測定 從平板上挑取單菌落，移入NB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期新鮮菌液1ml，12000g離心3min收集菌體，雙蒸水洗滌一次，60μL雙蒸水懸浮細(xì)胞，100℃水浴2min，13000g高速離心1min，上清作為DNA模板，-20℃?zhèn)溆茫瑓⒖技?xì)菌通用引物序列，上游引物F1：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT，下游引物R1：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA,由 生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反應(yīng)體系為25ul反應(yīng)體系：PCRmaster 12.5μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板（100ng/mL）0.5μL，加雙蒸水至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù) 變 性2min；95℃ 1min，59.4℃ 1min，72℃1min，30個循環(huán)；70℃延伸10min。

取5μLPCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用DNA Marker 作為參照。將PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測序。測序結(jié)果在GeneBank軟件對相近序列進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測序結(jié)果測序結(jié)果在NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析比對，發(fā)現(xiàn)未知菌X1的16s rRNA基因片段大小為1494 bp，未知菌X1為1491 bp。

測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)與未知菌X1匹配度最高的集中全序列是賴氨酸芽孢桿菌的各株系的16s rRNA序列，未知菌X2匹配度最高為環(huán)狀芽孢桿菌，其匹配度均高達(dá)99%。

系統(tǒng)發(fā)育樹根據(jù)軟件MEGA構(gòu)建進(jìn)化樹見圖X，分析菌株X1與Lysinibacillus菌屬的細(xì)菌具有較近的同源性。X2與Bacillus circulans具有較近的同源性。綜合前述的形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果，可判定試驗(yàn)分離得到的菌株為賴氨酸芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌。

討論

在通過對食品包裝用紙的微生物檢測過程中，大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌和溶血性鏈球菌都未曾檢出過，可能與食品包裝用紙生產(chǎn)的原料、加工工藝以及本身特性與食品不同。紙的原材料是木材，因此多見于動物糞便、蛋奶、肉類制品來源的大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌無法檢出。

市場上72批次食品包裝用紙中微生物檢測結(jié)果

而本次實(shí)驗(yàn)篩出的未知菌，以及大批量食品包裝用紙初篩過程中高檢出率的霉菌則都擁有一個特性，就是環(huán)境中存在的微生物，且都具有耐酸耐堿耐高壓耐高溫的芽孢。

賴氨酸芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌都屬于芽孢桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌，多發(fā)現(xiàn)于土壤、污水、木材等。賴氨酸芽孢桿菌和環(huán)狀芽孢桿菌不同的在于是指細(xì)胞壁上存在賴氨酸-天冬氨酸型肽聚糖。雖然二十世紀(jì)賴氨酸芽孢桿菌被認(rèn)為與熱帶潰瘍形成和皮膚或和呼吸道感染有關(guān)【3】，但很多實(shí)驗(yàn)都未證明這一結(jié)論【3、4】，仍不排除其安全風(fēng)險。

環(huán)狀芽孢桿菌一種革蘭氏陽性菌，也是是一種條件致病菌[5]。從微生物安全等級分類，它屬于4類安全微生物，但是它可以引起免疫功能受損患者患敗血癥，并導(dǎo)致患者死亡[5]，或是引起傷口感染[6]。這種細(xì)菌也能引起菌血癥、膿腫，并能引起人類腦膜炎[5]。

環(huán)狀芽孢桿菌是一種兼性厭氧菌。有氧存在，可以通過有氧呼吸產(chǎn)生ATP（三磷酸腺苷），無氧狀態(tài)下可以切換到無氧呼吸。實(shí)驗(yàn)證明環(huán)狀芽孢桿菌在4℃、30℃、36℃、42℃均可生長，最佳生長溫度范圍應(yīng)為30℃～36℃。在pH6-9的酸堿度范圍內(nèi)均可生長，最佳生長pH應(yīng)為7. 這種細(xì)菌能在營養(yǎng)匱乏產(chǎn)生內(nèi)孢子，孢子使細(xì)菌長時間處于休眠狀態(tài)，營養(yǎng)狀態(tài)良好時會重新激活，進(jìn)入營養(yǎng)階段。實(shí)驗(yàn)證明，內(nèi)孢子在高溫高壓高酸堿度情況下均可存活。

本次食品用包裝用紙微生物風(fēng)險篩查中，篩出的環(huán)狀芽孢桿菌是國家標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)控范圍外的具有致病風(fēng)險的條件致病菌，也是國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，希望在日后食品包裝用紙風(fēng)險檢測工作中提供理論和數(shù)據(jù)支持。