郝振凱，畢菲菲，韓貞艷，于詠蘭，索 勛，劉賢勇

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京海淀100193)

雞球蟲病是由球蟲感染引起的消化道疾病，對全世界的養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。球蟲為頂復門、艾美耳屬的細胞內(nèi)寄生蟲，能夠感染雞的球蟲有7種，包括堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、和緩艾美耳球蟲(E.mitis)、毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)、早熟艾美耳球蟲(E.praecox)和柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)[1]。它們在腸道的不同部位進行繁殖，破壞腸上皮細胞，引起消化吸收功能障礙，導致飼料轉(zhuǎn)化率降低、雞只生長遲緩等，嚴重時會造成雛雞大規(guī)模死亡。

抗球蟲藥物自使用以來，有效的降低了由球蟲病造成的經(jīng)濟損失，在養(yǎng)雞集約化和規(guī)?；l(fā)展過程中起到了十分重要的作用[2]。但由于抗球蟲藥物的長期使用，導致針對不同抗球蟲藥物的耐藥性球蟲的出現(xiàn)，從而引起了越來越嚴重的抗球蟲藥物耐藥性問題。據(jù)文獻公開報道，所有已大規(guī)模使用的抗球蟲藥物均已出現(xiàn)相應的耐藥蟲株。

1 雞球蟲耐藥性研究概況

目前廣泛使用的抗球蟲藥物中，有些藥物并不能殺死球蟲而是抑制其在宿主體內(nèi)的發(fā)育，一旦停止用藥，球蟲又能夠繼續(xù)發(fā)育繁殖；有的藥物則對某些種類球蟲的抑制作用或滅殺作用較差，例如巨型艾美耳球蟲和堆形艾美耳球蟲對氨丙啉不敏感，正常濃度下仍可產(chǎn)生大量卵囊[3]。由于這些客觀因素的存在，球蟲耐藥性的定義與其他物種耐藥性定義之間存在些許差異。寄生蟲學家Chapman認為球蟲耐藥性應該是指在正常可以殺死或抑制球蟲繁殖的藥物濃度下，某些蟲株仍具有存活或繁殖能力的現(xiàn)象[4]。

從1954年首次確認了對磺胺喹惡啉耐藥的蟲株以來[5]，已有大量關于發(fā)現(xiàn)并證實耐藥蟲株的報道。到目前為止，所有投入使用的抗球蟲藥都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了耐藥蟲株。盡管我國對球蟲耐藥性研究起步相對較晚，但在較短的時間內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了針對多種抗球蟲藥的耐藥蟲株(見中插彩版圖1)。此外，隨著研究的深入，研究者們還發(fā)現(xiàn)了具有多重耐藥性的球蟲，如對癸氧喹酯和氯羥吡啶多重耐藥的堆型艾美耳球蟲田間分離株[6]，甚至是對莫能菌素、馬杜霉素、尼卡巴嗪、常山酮、氯苯胍、地克珠利都有完全耐藥性的堆型艾美耳球蟲分離株[7]。

2 雞球蟲耐藥性檢測方法

2.1 籠飼試驗 雞體試驗是目前普遍使用的方法，結(jié)果也相對可靠。該方法是將藥物拌入飼料或加入飲水中飼喂給雞只，按照藥物特性一段時間后接種球蟲，通過相對卵囊產(chǎn)量(Relative oocyst production, ROP)、增重(Weight gain, WG)、病變積分減少率(Reduction of lesion scores, RLS)、最適抗球蟲活性百分率(Percent of optimum anticoccidial activity, POAA)、抗球蟲指數(shù)(Anticoccidial index ,ACI)、綜合抗藥指數(shù)(Global index, GI)等指標判斷是否存在耐藥性以及耐藥程度[8]。雖然這種方法比較可靠，但試驗耗時長，過程繁瑣，影響因素較多，同時需要大量的實驗動物和大量具有活力的卵囊等諸多限制因素。

2.2 細胞檢測 為了快速檢測球蟲耐藥性并避免雞體檢測的缺點，Strout等人創(chuàng)建了以柔嫩艾美耳球蟲為模型的體外篩選抗球蟲藥物的方法。該方法以子孢子的入侵率為指標判斷球蟲對藥物的敏感程度[9]。隨后Zhu利用這種培養(yǎng)體系發(fā)現(xiàn)了莫能菌素敏感蟲株和耐藥蟲株入侵能力的差異，同時發(fā)現(xiàn)了未能入侵細胞的敏感株子孢子在結(jié)構(gòu)上發(fā)生了改變[10]。Jenkins等人在該模式的基礎上通過定量PCR檢測球蟲特異性序列計算其入侵效率，進而建立了更加完善的體外檢測方法[11]。近期Ahmed等人在前人的基礎上建立了以繁殖抑制測試為指標的判定標準，通過這種方法測定聚醚離子載體類藥物敏感性的結(jié)果與雞體試驗的GI結(jié)果高度一致[12]。體外檢測與雞體試驗相比具有省時省力等優(yōu)點，但目前這種方法僅使用于聚醚離子載體類藥物，其他藥物的試驗結(jié)果相較于雞體試驗結(jié)果相差較大。

3 耐藥蟲株的實驗室誘導

在發(fā)現(xiàn)田間出現(xiàn)球蟲耐藥蟲株以后，研究者們就開始嘗試在實驗室誘導耐藥蟲株。目前主要有兩種誘導方法：(1)由Weppleman等創(chuàng)建的一步法，是在使用藥物推薦濃度下采用大劑量接種，只要排出足夠多的卵囊即認為是具有耐藥性的[13]。但使用這種方法誘導的耐藥蟲株需要大量的實驗動物，同時有研究發(fā)現(xiàn)使用該方法獲得的耐藥蟲株性狀并不穩(wěn)定，同時有些藥物采用這種方法并不能誘導出耐藥蟲株[14-15]；(2)藥物濃度遞增法：是指先以低于推薦藥物劑量開始誘導，然后逐漸提高藥物劑量，經(jīng)過多次傳代獲得耐藥蟲株。采用這種方法誘導的耐藥蟲株性狀穩(wěn)定，是當前普遍采用的誘導耐藥蟲株的方法。該方法的關鍵是確定起始藥物濃度以及藥物濃度梯度。常見的抗球蟲均可采用這種方法誘導出相應的耐藥性蟲株(表1)。使用藥物濃度遞增法誘導耐藥蟲株傳代次數(shù)并不固定，實驗動物越多、接種數(shù)量越大，耐藥蟲株產(chǎn)生的速度也越快[16]。

表1 藥物濃度遞增法誘導常見藥物的耐藥性

E.a表示堆型艾美耳球蟲；E.t表示柔嫩艾美耳球蟲

4 常見抗球蟲藥物耐藥機制研究

目前廣泛使用的抗球蟲藥物種類很多，但按其化學結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)過程主要可分為聚醚離子載體藥物和化學合成類藥物。不同的藥物都有其特定的作用機制，而耐藥性的產(chǎn)生與其關系密切。

4.1 聚醚離子載體類藥物 常見的聚醚離子載體類藥物包括莫能菌素、鹽霉素、馬杜霉素、那拉霉素、拉沙里霉素等。這類藥物是從不同的細菌培養(yǎng)物中提取的抗生素，在抑制球蟲的同時具有促進生長的作用，是目前廣泛使用的一類抗球蟲藥物。各類聚醚離子載體類藥物具有相似的作用機制，能夠擾亂子孢子或裂殖子內(nèi)的陽離子濃度，進而破壞正常的滲透壓，最終導致蟲體內(nèi)出現(xiàn)空泡并異常腫脹進而失去入侵宿主細胞的能力，主要作用于無性生殖階段[25]。

聚醚離子載體類藥物的敏感株與耐藥株對該類藥物的吸收具有明顯的差異，柔嫩艾美耳球蟲敏感株的子孢子對莫能菌素的吸收比耐藥株的吸收要高出很多[26]。除此之外，敏感蟲株與耐藥蟲株在轉(zhuǎn)錄水平上具有明顯差異，主要包括能量代謝、蛋白轉(zhuǎn)運、細胞骨架或細胞支架重排相關基因[27]。同時，差異蛋白的表達很有可能是耐藥蟲株出現(xiàn)的重要原因，Zhu等在莫能菌素耐藥蟲株的子孢子上發(fā)現(xiàn)了兩種分子量大約在50.0 kDa和31.4 kDa的蛋白而在敏感株上沒有發(fā)現(xiàn)[28]。近期通過蛋白質(zhì)組學的研究表明，97種鑒定出來的蛋白中有25種存在差異，其中肌動蛋白在耐藥蟲株中明顯上調(diào)表達而微線蛋白則顯著下調(diào)表達[29]。從目前的研究成果來分析，該類藥物耐藥蟲株的出現(xiàn)可能是由于蟲體內(nèi)的一系列的改變致使蟲體細胞壁發(fā)生變化，降低了藥物在蟲體內(nèi)聚集，使蟲體可以正常轉(zhuǎn)運陽離子進而使內(nèi)部滲透壓處于穩(wěn)定狀態(tài)。

4.2 磺胺類藥物 磺胺類藥物是最早發(fā)現(xiàn)并投入使用的抗球蟲藥，在很長一段時間內(nèi)都作為最重要的治療藥物來使用，同時磺胺類藥物第一個發(fā)現(xiàn)耐藥蟲株的藥物。其作用機理是抑制二氫葉酸合成酶的活性，阻止二氫葉酸合成，進而干擾葉酸正常代謝，實現(xiàn)抑制球蟲的目的，該類藥物主要作用于球蟲的裂殖生殖階段[30]。

通過對乙胺嘧啶和磺胺鄰二甲基嘧啶耐藥蟲株的研究發(fā)現(xiàn)，其耐藥性的產(chǎn)生與二氫葉酸還原酶和二氫蝶酸合成酶編碼基因的突變有關[31]。在弓形蟲上的研究已經(jīng)確認二氫葉酸還原酶的突變可以是乙胺嘧啶產(chǎn)生耐藥性出現(xiàn)的原因，并且突變后的該基因已經(jīng)作為藥物篩選基因在轉(zhuǎn)基因方面廣泛使用[32-33]。因此，球蟲對磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的原因很可能是二氫葉酸還原酶和二氫蝶酸合成酶編碼基因的突變，該突變導致了藥物與酶的結(jié)合能力降低進而使蟲體獲得抗性。

4.3 癸氧喹酯 體外試驗證實，癸氧喹酯可以阻斷球蟲線粒體內(nèi)的電子轉(zhuǎn)運過程，從而抑制球蟲細胞呼吸作用，影響能量代謝[34]。而且在使用該藥物的情況下，敏感蟲株即使產(chǎn)生少量卵囊，其孢子化率也非常低，研究發(fā)現(xiàn)，該藥物能夠造成卵囊出現(xiàn)染色體異常聯(lián)會的情況，這可能是卵囊不能正常孢子化的一個重要原因[35]。該藥物主要作用于子孢子和第1代裂殖子生殖階段，能夠阻止子孢子入侵，并抑制裂殖子生殖。

Ryley等人發(fā)現(xiàn)低濃度的癸氧喹酯就具有很好的抗球蟲作用，這表明球蟲可能會從周圍環(huán)境中吸收該藥物并在體內(nèi)聚集從而使蟲體內(nèi)的藥物濃度升高[36]。Wang提出對該類藥物耐藥性的產(chǎn)生可能與蟲體對藥物的吸收和聚集作用減弱有關[34]。但通過對癸氧喹酯產(chǎn)生耐藥性的瘧原蟲蟲株的研究確認，其耐藥性的出現(xiàn)與細胞色素B上的2個突變位點有關，盡管這一研究結(jié)果還沒有在球蟲上得到準確驗證，但國內(nèi)研究者已發(fā)現(xiàn)細胞色素B的基因突變會造成對該藥物敏感性的降低[37-38]。因此該藥物耐藥性出現(xiàn)的主要原因很有可能是作為靶蛋白的細胞色素B編碼基因突變，致使藥物的結(jié)合能力降低，而是解除了藥物對呼吸鏈電子轉(zhuǎn)運過程的阻斷。

4.4 氯羥吡啶 氯羥吡啶也是一種線粒體抑制劑類抗球蟲藥物，可以阻斷線粒體呼吸鏈的電子轉(zhuǎn)運，干擾能量代謝[5]。有研究表明，柔嫩艾美耳球蟲的二代裂殖子和配子體對氯羥吡啶格外敏感，但并不會影響子孢子的入侵[39]。

但該藥物的阻斷位點與癸氧喹酯不同，將兩種藥物混合在一起使用，即使降低藥物濃度也可以抑制線粒體的電子傳遞[40]。根據(jù)報道，這兩種藥物之間不存在交叉耐藥性，并且當與癸氧喹酯聯(lián)用時能更有效的抑制線粒體的電子轉(zhuǎn)移過程。因此，這兩種藥物雖然能抑制線粒體的功能但具有不同的作用機制[41]。

4.5 氨丙啉 氨丙啉的化學結(jié)構(gòu)與硫胺素相似，是硫胺素的拮抗劑。硫胺素在蟲體內(nèi)經(jīng)過進一步反應生成硫胺素焦磷酸，在體內(nèi)參與多種重要的碳水化合物代謝過程。而且氨丙啉比硫胺素更易被蟲體吸收，因此該藥物的使用可以減少蟲體對硫胺素的吸收，進而干擾碳水化合物代謝[42-43]。該藥物主要作用于裂殖子生殖階段，因而被廣泛用作治療藥物。盡管在田間已發(fā)現(xiàn)對該藥物敏感性下降的蟲株，但在實驗室誘導該藥物的耐藥蟲株卻相對困難，因此目前對其耐藥性的研究仍停留在臨床檢測階段。

4.6 三嗪類 該類藥物的代表為地克珠利和妥曲珠利。目前對該藥物的作用機制尚未完全解析，但已發(fā)現(xiàn)其對有性生殖和無性生殖階段均有抑制作用，因此可作為治療藥物和預防藥物。有研究表明，這類藥物可以通過抑制蟲體細胞核分裂，進而抑制裂殖體發(fā)育；可以使蟲體細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生膨脹，從而破壞蟲體內(nèi)細胞器的空間結(jié)構(gòu)；可以抑制球蟲呼吸過程中關鍵酶活性，阻斷蟲體內(nèi)的呼吸作用，影響能量代謝[44-45]。

近期的研究主要在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平發(fā)現(xiàn)了該類藥物對柔嫩艾美耳球蟲體內(nèi)蛋白表達的影響。國內(nèi)研究者發(fā)現(xiàn)地克珠利對柔嫩艾美耳球蟲的微線蛋白、乳酸脫氫酶、蛋白激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、熱休克蛋白90、新型蘇氨酸等蛋白的表達水平都具有調(diào)控作用[46-49]。通過轉(zhuǎn)錄組測序分析地克珠利耐藥蟲株與敏感蟲株第二代裂殖子發(fā)現(xiàn)差異表達的基因有頂膜抗原-1、海藻糖-6-磷酸合酶1亞基、胸苷酸激酶假定蛋白等16個基因[50]。通過蛋白組學的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)地克珠利處理后有13種蛋白質(zhì)的表達受到影響，但只能注釋出其中11種蛋白的功能[51]。從目前的研究成果來看，該類藥物很可能作用于多個靶基因，從而影響蟲體內(nèi)多種代謝通路，但其耐藥性的產(chǎn)生機制目前仍未進行深入研究。

5 展望

由于球蟲耐藥性日益嚴重，田間分離獲得的艾美耳球蟲株已很難發(fā)現(xiàn)完全敏感的蟲株。但由于受到檢測方法的限制，導致球蟲耐藥性研究一直以來進展緩慢。盡管實驗室誘導耐藥蟲株可以為其研究提供很好的素材，但它仍不能完全代替田間分離株。因此我們亟需找到一種快速、簡單、準確的檢測田間分離株的方法。

目前對抗球蟲藥物的作用機制和耐藥性產(chǎn)生機制仍處于初步階段，很多藥物的作用機制是借鑒體外細胞試驗和其他原蟲的研究成果。隨著分子生物學技術的發(fā)展，特別是球蟲基因編輯技術的成熟，為解析抗球蟲藥物的作用機理、球蟲耐藥性產(chǎn)生機制和耐藥基因的篩選提供了有效的技術支持。近年來基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學的普及，進一步促進了雞球蟲耐藥性的研究。解析不同蟲種的艾美耳球蟲對不同種抗球蟲藥物的耐藥性機制對指導合理用藥，減緩耐藥性的產(chǎn)生以及新的抗球蟲藥物的研發(fā)等都具有重要意義。