張葉 李媛媛 徐建 陳曦 王彬 付雷 陸宇

亞胺吩嗪類藥物具有很強(qiáng)的體內(nèi)外抗結(jié)核和抗炎活性作用，以及抑制耐藥菌株的較強(qiáng)作用[1]。該類藥物中氯法齊明的抗MTB活性已得到證實(shí)，并被世界衛(wèi)生組織推薦為耐多藥結(jié)核病的二線核心治療藥物[2]，故其結(jié)構(gòu)改造物不斷地被合成和篩選[3-4]，其中吡法齊明因活性更強(qiáng)、不良反應(yīng)更弱而成為我國首個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的療效明確且安全性更高的抗MTB新藥[3, 5]。目前，吡法齊明已進(jìn)入Ⅰ期臨床研究，但尚未見該藥作用機(jī)制的研究報(bào)道，對其機(jī)制的探討均基于對氯法齊明的研究，其中細(xì)胞內(nèi)的氧化還原循環(huán)是氯法齊明介導(dǎo)的較公認(rèn)的抗結(jié)核作用機(jī)制，該理論源于首先合成氯法齊明的Barry等[6]的研究，其認(rèn)為氯法齊明可能是通過在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的氧化還原反應(yīng)生成大量具有抗菌活性的活性氧而起作用。本研究通過測定氯法齊明和吡法齊明刺激前后菌體內(nèi)活性氧水平和不同氯法齊明和吡法齊明耐藥表型的MTB過氧化氫酶活性，初步探討其作用機(jī)制及過氧化氫酶活性與MTB氯法齊明和吡法齊明耐藥表型間的關(guān)系。

材料和方法

一、研究材料

1.菌株：以1、2、4、8倍于最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的氯法齊明和吡法齊明處理H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 27294，對氯法齊明和吡法齊明均敏感)24 h，應(yīng)用熒光探針2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)活性氧檢測試劑盒測定藥物處理后MTB菌體內(nèi)的活性氧含量水平，比較不同濃度的氯法齊明和吡法齊明作用前后菌體內(nèi)活性氧水平變化。以過氧化氫酶活性檢測試劑盒測定5株對氯法齊明和吡法齊明均耐藥、3株對氯法齊明耐藥但對吡法齊明敏感、1株對氯法齊明和吡法齊明均敏感(編號(hào)13385)的MTB臨床分離株及H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的過氧化氫酶活性，比較氯法齊明和吡法齊明耐藥菌株與敏感菌株的過氧化氫酶活性的差異。所有菌株均來源于本研究室保存的300株耐多藥菌株，并經(jīng)MIC篩選后獲得。表型藥物敏感性試驗(yàn)通過微孔培養(yǎng)顯色法(microplate alamar blue assay，MABA)進(jìn)行測定。

2.儀器與試劑：Tecan Infinite 200多功能酶標(biāo)儀，Nuaire701二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，Thermo ScientificMicro 21R高速冷凍離心機(jī)等。吡法齊明對照品(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供，批號(hào)HCⅢⅠ-13701-1)，氯法齊明對照品(上海瀚香生物科技公司，批號(hào)20150888)，7H9液體培養(yǎng)基干粉(美國BD公司，批號(hào)4099145)，Middlebrook OADC增菌液(美國BD公司，批號(hào)6237601)，吐溫80(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)301C052)，丙三醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180223)，二甲基亞砜(美國VWR公司，批號(hào)67-68-5)?；钚匝鯔z測試劑盒和過氧化氫酶活性檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

二、MTB菌體內(nèi)活性氧含量測定

本研究中使用DCFH-DA試劑盒進(jìn)行MTB菌體內(nèi)活性氧檢測。具體步驟如下：

1.菌液及藥物的配制和探針的稀釋：將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株菌液混勻，以7H9培養(yǎng)基將菌液稀釋為1×107菌落形成單位(CFU)/ml后，將菌液分裝于12個(gè)1.5 ml的離心管中，每管1.0 ml。以二甲基亞砜配制氯法齊明和吡法齊明儲(chǔ)備液，濃度均為2.4 mg/ml(初始濃度)。以7H9培養(yǎng)基將氯法齊明儲(chǔ)備液稀釋為0.24 mg/ml(1 MIC)、0.48 mg/ml(2 MIC)、0.96 mg/ml(4 MIC)、1.92 mg/ml(8 MIC)；將吡法齊明儲(chǔ)備液稀釋為0.06 mg/ml(1 MIC)、0.12 mg/ml(2 MIC)、0.24 mg/ml(4 MIC)、0.48 mg/ml(8 MIC)；將10 mol/L 的熒光探針DCFH-DA稀釋1000倍，使其終濃度為10 μmol/L。

2.藥物處理：將試劑盒提供的1 μl(1個(gè)單位)和5 μl的活性氧陽性對照試劑(分別為1U-Rosup和5U-Rosup)，以及稀釋好的各濃度氯法齊明和吡法齊明溶液各1 μl分別加入至其中10個(gè)離心管中，作為菌體細(xì)胞陽性刺激管；剩余2管作為陰性對照?；靹蚝髮㈦x心管放入含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃ 孵育24 h。

3.加載探針：將孵育好的各樣品以8000×g離心10 min，棄上清，各管分別加入1 ml濃度為10 μmol/L 的熒光探針DCFH-DA，混勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，使探針和菌體細(xì)胞充分接觸。再以7H9培養(yǎng)基洗滌菌體細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

4.活性氧的測定：分別吸取10管菌體細(xì)胞陽性刺激管中菌液各200 μl至96孔板中，每管加入2個(gè)微孔；再分別吸取2管陰性對照管菌液、7H9培養(yǎng)基、H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株菌液和試劑盒提供的Rosup活性氧陽性對照試劑各200 μl至96孔板中，每管加入2個(gè)微孔。使用多功能酶標(biāo)儀實(shí)時(shí)檢測不同條件刺激后的菌體細(xì)胞熒光強(qiáng)度值，設(shè)定激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。本研究以試劑盒提供的陽性對照試劑Rosup、1U-Rosup、5U-Rosup處理的菌體細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值作為陽性對照參數(shù)，以測定可能影響結(jié)果的熒光強(qiáng)度值作為陰性對照參數(shù)，包括7H9培養(yǎng)基、H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株+DCFH-DA(無藥物刺激)。

三、MTB胞內(nèi)過氧化氫酶活性測定

本研究是利用過氧化氫酶能夠分解過氧化氫的反應(yīng)，以及反應(yīng)溶液在240 nm下呈現(xiàn)特征性吸收峰，即吸光度值隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而降低的特性，來測定過氧化氫溶液吸光度值的變化情況以計(jì)算過氧化氫酶的活性(CAT)。以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和兩藥敏感菌株的過氧化氫酶的活性值作為對照，測定兩藥耐藥菌株的過氧化氫酶活性，以比較耐藥株與敏感株的過氧化氫酶活性是否存在差別。

1.MTB粗酶液提?。涸谶m量培養(yǎng)至對數(shù)期的MTB[包括H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、13385菌株，以及8株對氯法齊明和(或)吡法齊明耐藥菌株]菌液(約5×106個(gè))中加入 1 ml試劑盒提供的過氧化氫酶提取液，使得細(xì)菌數(shù)量(104個(gè))∶提取液體積(ml)為500∶1。超聲波(功率200 W)破碎細(xì)菌或細(xì)胞3 min，間隔10 s，重復(fù)30 次。超聲破碎后離心，取上清置于冰上待測。

2.測定樣品吸光度值：取過氧化氫酶活性檢測試劑盒中1 ml檢測工作液(含過氧化氫)于1 ml石英比色皿中，再加入35 μl上一步粗提取樣本，混勻5 s；室溫下立即測定240 nm下的初始吸光度值A(chǔ)1和1 min后的吸光度值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。將每1萬個(gè)細(xì)菌在反應(yīng)體系中每分鐘催化1 nmol過氧化氫降解定義為1個(gè)酶活力單位，根據(jù)ΔA計(jì)算過氧化氫酶活性(U/104cell)，吸光度值越低過氧化氫酶活性越高。根據(jù)試劑盒提供的公式，CAT活性(U/104cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=1.356×ΔA。其中CAT活性：過氧化氫酶活性；V反總：反應(yīng)體系總體積，1.035×10-3L；ε: 過氧化氫摩爾吸光系數(shù)，4.36×104L·mol-1·cm-1；d：比色皿光徑，1 cm；V樣：加入樣本體積，0.035 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；500：細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對吡法齊明藥物處理濃度與所測得的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析和線性回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 陰陽性對照試劑活性氧的熒光強(qiáng)度值測定結(jié)果

本研究以試劑盒提供的陽性對照試劑Rosup、1 U-Rosup和5 U-Rosup處理的菌體細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值作為陽性對照參數(shù)，以測定的可能影響結(jié)果的各個(gè)組分的熒光強(qiáng)度值作為陰性對照參數(shù)，包括7H9培養(yǎng)基、H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株+DCFH-DA(無藥物刺激)的陰性對照樣品，其中7H9培養(yǎng)基、H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的熒光強(qiáng)度值最低，均<500；而H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株+DCFH的熒光強(qiáng)度值較高，在800～1000之間。而陽性對照樣品中，Rosup 熒光強(qiáng)度值過高，不能檢測；1 U-Rosup和5 U-Rosup處理的菌體細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值明顯較陰性對照增高，但兩者數(shù)值差別不明顯。各對照孔測得的具體熒光強(qiáng)度值見表1。

二、不同濃度氯法齊明和吡法齊明刺激H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株后的菌體細(xì)胞活性氧含量測定

不同濃度氯法齊明和吡法齊明刺激H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株后的菌體細(xì)胞熒光強(qiáng)度值隨著時(shí)間延長而不斷增高，20 min左右趨于穩(wěn)定，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度氯法齊明和吡法齊明刺激后，菌體細(xì)胞內(nèi)積累的活性氧含量(即熒光強(qiáng)度值水平)均明顯增加，至少是無藥物刺激的陰性對照菌株(H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株+DCFH-DA)的2倍。各微孔測得的具體熒光強(qiáng)度值見表2。

在不同濃度氯法齊明處理的菌株中，1倍MIC的氯法齊明處理的菌體細(xì)胞熒光強(qiáng)度值最高，2個(gè)微孔不同藥物濃度處理樣本測定的平均熒光強(qiáng)度值排序?yàn)? MIC>8 MIC>2 MIC>4 MIC，各樣本藥物處理濃度和熒光強(qiáng)度值均值間無統(tǒng)一的變化趨勢，未進(jìn)行相關(guān)和回歸分析。而在各濃度吡法齊明處理的菌株中，菌株測定的熒光強(qiáng)度值與藥物濃度之間存在明顯的劑量依賴性，2個(gè)微孔不同藥物濃度處理樣本的熒光強(qiáng)度值均值排序?yàn)? MIC>4 MIC>2 MIC>1 MIC，濃度隨熒光強(qiáng)度值的增高而增高，呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)(Spearman相關(guān)性分析，r=0.976,P<0.001)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度吡法齊明處理的菌株測得的熒光強(qiáng)度值隨著濃度的加倍，熒光強(qiáng)度值增高的數(shù)值基本一致，故對吡法齊明濃度和熒光強(qiáng)度值做線性回歸分析。首先以處理用吡法齊明的濃度為X，測得的熒光強(qiáng)度值為Y做散點(diǎn)圖，并作線性擬合趨勢線，如圖1可見各點(diǎn)基本在一條直線上，統(tǒng)計(jì)分析求得線性趨勢擬合方程為Y=2539.130X+1848.130，判定系數(shù)R2=0.979?；貧w方程檢驗(yàn)結(jié)果顯示F=92.576，P=0.011，回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 吡法齊明處理濃度與熒光強(qiáng)度值的線性回歸擬合曲線

三、MTB的過氧化氫酶活性測定

以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和13385臨床分離株作為敏感對照，對8株氯法齊明耐藥菌株的過氧化氫酶活性進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株與13385臨床分離株的過氧化氫酶活性分別為0.54 U/104cell和0.41 U/104cell，均值為0.48 U/104cell；而8株氯法齊明耐藥菌株的過氧化氫酶活性范圍在0.68～1.08 U/104cell，均值為0.87 U/104cell(表3)，明顯高于13385菌株和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株將近2倍。

表1 陰陽性對照試劑測定的活性氧熒光強(qiáng)度值

注編號(hào)1、2為測定的2個(gè)平行孔；1 U-Rosup為菌體經(jīng)1個(gè)單位Rosup處理，5 U-Rosup為菌體經(jīng)5個(gè)單位Rosup處理；Overflow為測定值過高

表2 不同濃度氯法齊明和吡法齊明刺激菌體細(xì)胞后的活性氧含量測定結(jié)果

表3 各菌株過氧化氫酶活性測定結(jié)果

注A1：初始吸光度值；A2：藥物作用1 min后的吸光度值；ΔA=A1-A2；CAT：過氧化氫酶

對5株吡法齊明敏感菌株(H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株、13385臨床分離株、8株氯法齊明耐藥菌株中3株對吡法齊明敏感)與5株耐藥菌株的測定結(jié)果顯示，吡法齊明敏感菌株的過氧化氫酶活性范圍在0.41～0.95 U/104cell，均值為0.71 U/104cell，且過氧化氫酶活性高低不等、范圍較廣；而吡法齊明耐藥菌株的過氧化氫酶活性范圍在0.80～1.08 U/104cell，均值為0.88 U/104cell(表3)，均高于吡法齊明敏感菌株，但與氯法齊明耐藥菌株均值相近。

討 論

氯法齊明合成已超過60年時(shí)間，在其合成伊始，就因其良好的體外抗結(jié)核活性引起了臨床的廣泛重視，但對其作用機(jī)制的研究僅局限于數(shù)種假說[7-10]，其中對“氯法齊明通過在菌體內(nèi)發(fā)生氧化還原反應(yīng)并不斷累積活性氧(主要為過氧化氫和過氧化物)而發(fā)揮抗菌活性”的假說認(rèn)可度最高?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，氯法齊明主要作用在細(xì)菌呼吸鏈和離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上，如Barry等[6]提出了氯法齊明可能通過活性氧起作用，而Yano等[7]做了進(jìn)一步闡述，認(rèn)為氯法齊明是一種前體藥物，可以在Ⅱ型NADH醌氧化還原酶(NADH-quinone oxidoreductase type 2, NDH-2)的作用下被NADH還原為活性形式，再和O2自發(fā)氧化反應(yīng)并釋放活性氧，當(dāng)胞內(nèi)的活性氧濃度積累至1.0 mmol/L左右后即開始發(fā)揮殺菌作用。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)菌更容易產(chǎn)生氯法齊明耐藥性，提示氯法齊明抗結(jié)核作用的發(fā)揮離不開一系列的氧化還原反應(yīng)[8]。也有研究認(rèn)為，K+轉(zhuǎn)運(yùn)體是氯法齊明的主要作用靶點(diǎn)，磷脂酶A2是K+轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑，氯法齊明可以通過增加磷脂酶A2的活性和減少K+的吸收來抑制細(xì)菌K+轉(zhuǎn)運(yùn)體和細(xì)菌腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的產(chǎn)生而發(fā)揮抗菌作用[9]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)氯法齊明可以增加巨噬細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞胞內(nèi)半胱天冬酶-3的表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡[10]。

本研究通過測定氯法齊明和吡法齊明作用MTB前后菌體細(xì)胞內(nèi)活性氧含量水平，以及對氯法齊明和吡法齊明敏感或耐藥的菌株中過氧化氫酶的活性水平，對吡法齊明的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，分析吡法齊明是否具有與氯法齊明相類似的作用機(jī)制，即是否通過在MTB胞內(nèi)積累活性氧來發(fā)揮殺菌作用。本研究使用的活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。該試劑盒的應(yīng)用基于以下原理：DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，在其進(jìn)入細(xì)胞后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH而生成有熒光的DCF。因此檢測DCF的熒光強(qiáng)度值就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

在MTB活性氧測定中，本研究發(fā)現(xiàn)MTB在經(jīng)氯法齊明和吡法齊明處理24 h后菌體內(nèi)均積累了至少2倍原有活性氧含量的水平，提示活性氧在氯法齊明和吡法齊明抑制MTB的過程中起到了重要作用，兩藥可能有著相似的作用機(jī)制；但有研究表明，相對于氯法齊明，吡法齊明對MTB臨床敏感株和耐藥株的體外實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用[3]，在動(dòng)物模型中也表現(xiàn)出更強(qiáng)的療效[3, 11]，即服用吡法齊明的小鼠肺組織中的檢測菌量僅為服用同樣劑量氯法齊明小鼠的1%左右[3]，說明吡法齊明的治療效果高于氯法齊明；而且，藥代動(dòng)力學(xué)研究也進(jìn)一步表明，當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)吡法齊明的血藥濃度在3～30 mg/kg 范圍時(shí)，其血藥濃度與生物利用度呈線性動(dòng)力學(xué)過程，且動(dòng)物性別可明顯影響血藥濃度達(dá)峰時(shí)間和峰濃度以及生物利用度[12]。同時(shí)，也觀察到幾個(gè)值得注意的現(xiàn)象：一是在各濃度氯法齊明處理的MTB菌株中，經(jīng)1倍MIC濃度氯法齊明處理的菌體細(xì)胞活性氧含量水平最高，而經(jīng)2倍、4倍和8倍 MIC濃度氯法齊明處理各組菌株的活性氧水平相差不大，且均明顯低于1倍MIC濃度氯法齊明處理的活性氧含量水平，可能與1倍MIC濃度的氯法齊明對MTB的抑制效果低于其他處理濃度，保留了較高比例菌體細(xì)胞的活性，使24 h的孵育過程中有更多的MTB生長復(fù)制并加載了探針，導(dǎo)致1倍MIC濃度氯法齊明處理的菌體細(xì)胞活性氧水平明顯高于其他處理濃度。而在吡法齊明處理的各菌株中，可能由于實(shí)驗(yàn)中以相對較高的濃度(0.04 μg/ml)作為吡法齊明的1倍MIC，導(dǎo)致其藥物活性較氯法齊明更強(qiáng)，表現(xiàn)為菌株測定的熒光強(qiáng)度值與藥物濃度之間存在明顯的劑量依賴性，Spearman相關(guān)性分析呈正相關(guān)，即各濃度藥物處理樣本的平均熒光強(qiáng)度值排序?yàn)? MIC>4 MIC>2 MIC>1 MIC，這一結(jié)果說明MTB接觸的吡法齊明的濃度越高，菌體內(nèi)積累的活性氧含量水平越高，提示菌體內(nèi)活性氧的生成與吡法齊明的含量有直接關(guān)系，與上述文獻(xiàn)一致。二是進(jìn)一步經(jīng)線性回歸分析顯示，吡法齊明處理菌株的熒光強(qiáng)度值與處理用吡法齊明的濃度間呈線性正相關(guān)，從另一角度證明了吡法齊明濃度越高熒光強(qiáng)度值越高，這一現(xiàn)象不僅支持了吡法齊明抗菌作用的發(fā)揮與菌體內(nèi)積累的活性氧含量水平有關(guān)，同時(shí)也提示了菌體內(nèi)吡法齊明的濃度可以隨著菌體外加入的吡法齊明濃度的提高而提高，考慮可能與吡法齊明進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)不會(huì)受到菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的阻礙有關(guān)，而氯法齊明的給藥濃度與測定的熒光強(qiáng)度值并沒有表現(xiàn)出正相關(guān)的原因很可能與氯法齊明不能完全進(jìn)入菌體內(nèi)有關(guān)，2倍MIC濃度的氯法齊明即達(dá)到了進(jìn)入菌體細(xì)胞的飽和濃度，因而表現(xiàn)出2倍、4倍和8倍氯法齊明處理后測得的熒光強(qiáng)度值相差不大。

過氧化氫酶廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是最主要的過氧化氫清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶是各種微生物細(xì)胞抵抗活性氧脅迫的最主要方式，特別是芽孢桿菌屬的微生物，可以將過氧化氫和超氧陰離子轉(zhuǎn)變成無毒的水[13]。早在1957年，Barry等[6]就提出氯法齊明形成的活性氧中主要為超氧化物和過氧化氫，提示若菌株中過氧化氫酶活性增高，則氯法齊明合成的活性氧的量必然會(huì)受到影響。但1992年Van Rensburg等[14]通過對革蘭陽性菌的研究發(fā)現(xiàn)，菌株是否對氯法齊明耐藥與過氧化氫酶狀態(tài)無關(guān)，認(rèn)為氯法齊明不是通過形成過氧化氫發(fā)揮抗菌作用，這與Barry等[6]和Yano等[7]提出的假設(shè)是不一致的；但是，需要注意的是該研究僅以不包括MTB在內(nèi)的另3種革蘭陽性菌為研究對象，且具體數(shù)據(jù)表明這3種革蘭陽性菌在從有氧環(huán)境換為無氧環(huán)境后，其對氯法齊明的MIC均有降低，這一現(xiàn)象應(yīng)當(dāng)僅能提示革蘭陽性菌在無氧環(huán)境下更容易被氯法齊明抑制，而不能認(rèn)為氯法齊明的耐藥表型與過氧化氫酶狀態(tài)無關(guān)。

在過氧化氫酶檢測過程中發(fā)現(xiàn)，可納入的對氯法齊明和(或)吡法齊明耐藥的菌株僅8株，且其中有5株對吡法齊明耐藥，提示兩藥的耐藥率均很低，且吡法齊明的耐藥率低于氯法齊明。另外，測定的8株氯法齊明耐藥菌株的過氧化氫酶活性均較13385菌株及H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株更高，提示氯法齊明耐藥菌株對過氧化氫的分解作用更強(qiáng)，導(dǎo)致氯法齊明作用后的菌體內(nèi)過氧化氫含量和活性氧總水平相對更低；同時(shí)也從代謝產(chǎn)物的角度上支持了氯法齊明是通過合成活性氧發(fā)揮抗菌活性作用的假說，并以臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果做了驗(yàn)證，而這一假說此前的研究僅局限于實(shí)驗(yàn)室模型菌株；而且，這一假說還可以用來解釋前期研究中一些待討論的現(xiàn)象。Ammerman 等[15]測試了多種濃度氯法齊明的體內(nèi)外抗菌活性后，發(fā)現(xiàn)各種濃度的氯法齊明在第1周內(nèi)均未表現(xiàn)出明顯的抗菌活性，而在第2周則可以觀察到氯法齊明的抗菌活性隨藥物濃度或劑量的增高而增強(qiáng)，但濃度或劑量的提高并未使氯法齊明抗菌活性的出現(xiàn)時(shí)間提前，呈現(xiàn)出活性延遲現(xiàn)象，推測可能原因如下：一是，氯法齊明首先需要使富含脂質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞壁飽和后才能作用到菌體內(nèi)；二是，破壞電化學(xué)H+梯度的質(zhì)子動(dòng)力勢，阻礙其合成ATP需要一定的時(shí)間；三是，在觀察到抗菌活性之前需要消耗菌體內(nèi)所存儲(chǔ)的能量。如果從“氯法齊明需要通過胞內(nèi)累積活性氧而起作用”這一假說來推測，這一現(xiàn)象可能提示提高氯法齊明的濃度或劑量僅能加快氯法齊明在組織中的累積而不能加快氯法齊明或活性氧在MTB菌胞內(nèi)的累積。

聯(lián)合分析吡法齊明的活性氧水平和過氧化氫酶活性測定結(jié)果提示，在用吡法齊明處理菌體細(xì)胞后，菌體內(nèi)活性氧水平增高，且測定值與氯法齊明處理后的活性氧水平相近，提示吡法齊明可以通過菌體內(nèi)活性氧的累積發(fā)揮殺菌活性，可能有類似氯法齊明的作用機(jī)制。但是，過氧化氫酶活性測定結(jié)果顯示MTB胞內(nèi)過氧化氫酶活性與MTB對吡法齊明的耐藥表型無關(guān)，顯示過氧化氫酶活性增高的菌株不一定對吡法齊明耐藥，可能提示氯法齊明耐藥范圍較吡法齊明更廣泛，也可能提示吡法齊明的作用和耐藥機(jī)制與氯法齊明類似但不完全相同；例如，吡法齊明在處理菌體后，若菌體中主要累積的活性氧為超氧化物，則菌體內(nèi)過氧化氫酶活性增高不會(huì)表現(xiàn)為與吡法齊明耐藥表型一致。

本研究首次對吡法齊明的作用機(jī)制進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)吡法齊明的作用機(jī)制可能與氯法齊明一致，即抗菌作用的發(fā)揮與菌體內(nèi)活性氧的累積水平相關(guān)。同時(shí)，本研究也存在一些不足，一是由于氯法齊明和吡法齊明的耐藥率相對較低，本研究僅應(yīng)用了對氯法齊明和吡法齊明均敏感的13385菌株和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株，以及8株對氯法齊明或吡法齊明耐藥的菌株對吡法齊明的抗結(jié)核作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，對結(jié)論的支持不足，后續(xù)還需要選取更多的臨床耐藥菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果；二是吡法齊明通過在菌體內(nèi)積累活性氧以實(shí)現(xiàn)抗結(jié)核作用的具體作用途徑尚不清楚，仍需要進(jìn)一步的研究確證。