楊雙 郭婧瑋 胡一敏 譚云洪 譚笑 袁仕善

目前，用于結(jié)核病診斷的分子生物學(xué)技術(shù)因敏感度和特異度較高，受到世界衛(wèi)生組織的推薦[1]。張培澤等[2]研究發(fā)現(xiàn)，新一代超敏全自動(dòng)巢式實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)是目前診斷結(jié)核性腦膜炎敏感度較高的方法，但該方法成本昂貴，限制了其在貧困地區(qū)的廣泛使用。實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，以結(jié)核分枝桿菌抗原包被載體的膠體金法已經(jīng)作為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測(cè)方法用來輔助診斷結(jié)核病，但目前仍然沒有篩選和確定能完全滿足結(jié)核病血清學(xué)診斷需求的抗原種類，還需要大量基礎(chǔ)研究進(jìn)行論證。當(dāng)前研究較多的結(jié)核分枝桿菌抗原主要包括培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)、早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)、Ag85A、Ag85B、相對(duì)分子質(zhì)量38 000(38 kDa)抗原、MPT64、熱休克蛋白(heat shock protein， Hsp)16.3等[3-6]。免疫共沉淀是一種廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的經(jīng)典技術(shù)，但較少用于結(jié)核病抗原抗體的相互作用和篩選，本研究采用免疫共沉淀和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩選和鑒定結(jié)核分枝桿菌的血清學(xué)抗原，以期為結(jié)核病的血清學(xué)診斷提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料與試劑

收集2013年2—7月湖南省結(jié)核病防治所確診的首次入院的初治結(jié)核病患者，達(dá)到30例后停止納入，收集其血清，作為研究材料；患者納入標(biāo)準(zhǔn)為病程記錄未提示耐藥，涂片抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)均為陽性。收集2013年7月湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科接收的健康體檢者，達(dá)到20例后停止納入，收集其血清，用于做血清學(xué)抗原免疫印跡(Western blot，WB)分析時(shí)進(jìn)行對(duì)照；納入標(biāo)準(zhǔn)為，經(jīng)X線攝影、血紅細(xì)胞沉降率試驗(yàn)、血常規(guī)等體檢項(xiàng)目檢查，結(jié)果均為正常，且無任何臨床癥狀。

結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由湖南省結(jié)核病防治所檢驗(yàn)科提供；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自湖南艾佳生物科技股份有限公司；免疫共沉淀試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；硝酸纖維素膜(NC膜)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗人免疫球蛋白G(IgG)購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

二、方法

1. 結(jié)核陽性血清IgG的提?。簭氖占慕Y(jié)核病患者血清中采用隨機(jī)數(shù)字表抽樣法抽取20份(例)提取血清IgG篩選抗原[另外10份(例)血清用于WB驗(yàn)證篩選的抗原能否被此10例混合血清特異性識(shí)別]血清各200 μl，混勻后用飽和硫酸銨分級(jí)沉淀法提取血清IgG，以磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行透析，去除銨離子(NH4+)，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2. 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株菌體抗原的制備：批量接種結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株于改良羅氏培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4周。通過接種環(huán)刮取菜花狀菌落于丙酮溶液脫脂。加入滅菌PBS重懸菌體，85 ℃水浴30 min，滅菌。反復(fù)凍融6次，冰浴超聲，以12 000×g高速離心30 min，收集上清，制備菌體抗原。BCA法測(cè)定抗體及粗制抗原濃度。

3. 抗體IgG與瓊脂糖蛋白A/G的交聯(lián)：輕搖瓊脂糖瓶使瓊脂糖懸浮，加于微型柱中，通過柱平衡液洗滌。取10 μg上述提取的20份(例)結(jié)核病患者混合血清抗體IgG，加于微型柱中，于振蕩器上室溫孵育1 h，使抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的抗體。加入二甲基亞砜(DMSO)溶解辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)，將溶解的DSS加于結(jié)合的微型柱，使抗體與蛋白A/G交聯(lián)。洗滌去除未交聯(lián)的抗體。

4. 結(jié)核分枝桿菌菌體抗原的免疫共沉淀：取結(jié)核分枝桿菌粗制抗原溶液600 μl，加入至抗體交聯(lián)完成的微型柱中，輕搖混勻，置4 ℃放置過夜，使抗原抗體充分結(jié)合。以5228×g離心1 min，加洗滌緩沖液洗滌微型柱。通過12%凝膠濃度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS -PAGE)進(jìn)行分析。

5. 血清學(xué)抗原的WB分析：將洗脫抗原及菌體粗制抗原進(jìn)行12%SDS-PAGE分離，通過150 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。將30份(例)結(jié)核病患者血清剔除提取過抗體IgG的20份(例)，取剩余的10份(例)血清混勻，從收集的健康體檢者血清中采用隨機(jī)數(shù)字表抽樣法抽取10份(名)混勻(與結(jié)核病患者血清組樣本數(shù)保持一致，剩余血清暫時(shí)不再使用)，分別以1∶50稀釋，37 ℃溫浴2 h，再以磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次，以1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗人IgG為二抗，37 ℃ 溫浴1 h，PBST洗膜3次，通過DAB顯色，觀察結(jié)果。

6. 質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索：根據(jù)WB陽性結(jié)果，分析電泳后蛋白條帶，切取結(jié)核病患者血清識(shí)別的特異條帶置微孔板，用乙腈溶液脫色并干燥。將含12.5 mg/L的胰蛋白酶消化液加入膠條，37 ℃消化過夜。通過含甲酸500 ml/L的乙腈溶液提取，收集上清，于氮?dú)庵斜Ｗo(hù)干燥，重溶于含20 ml/L乙腈溶液和10 ml/L三氟乙酸溶液。將樣品進(jìn)樣至串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜主機(jī)基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)(Tempo LC-MALDI)點(diǎn)靶系統(tǒng)。樣品在含20 ml/L乙腈溶液和1 ml/L三氟乙酸緩沖液與含980 ml/L乙腈溶液和1 ml/L三氟乙酸緩沖液梯度范圍內(nèi)洗脫，洗脫的餾分以1∶1的比例與含10 mmol/L磷酸銨的7 g/L α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)基質(zhì)混合，點(diǎn)樣至飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(OPTI-TOF LC/MALDI)的123 mm×81 mm平板(應(yīng)用生物系統(tǒng))。以美國(guó)AB SCIEX公司生產(chǎn)的5800 MALDI TOF/TOF分析儀分析基質(zhì)輔助激光解吸電離樣品(MALDI)板。分析的數(shù)據(jù)以軟件GPS(V3.6)檢索。搜索參數(shù)如下：數(shù)據(jù)庫為NCBInr 20100724，11505486序列，3925745078殘基，且限定物種為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(27212序列)，胰酶酶切，一個(gè)漏切位點(diǎn)，一級(jí)質(zhì)譜的容差為100 ppm(1 ppm=1 mg/kg)，二級(jí)質(zhì)譜的容差為0.6 Da(1 Da=1 g/mol)。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索后，肽得分大于23分被認(rèn)為鑒定成功(P<0.05)。

結(jié) 果

一、免疫共沉淀篩選血清學(xué)抗原

以BCA蛋白定量法測(cè)定結(jié)核分枝桿菌菌體粗制抗原蛋白濃度為418 mg/L，粗制抗原與經(jīng)交聯(lián)免疫共沉淀試劑盒免疫共沉淀獲得純化抗原的SDS-PAGE見圖1。由圖可知，在相對(duì)分子質(zhì)量約為16 000(16 kDa)處獲得一條能被結(jié)核病患者血清抗體特異性識(shí)別的蛋白質(zhì)條帶。

M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：結(jié)核分枝桿菌粗制抗原；2：結(jié)核分枝桿菌免疫共沉淀純化抗原圖1 免疫共沉淀純化抗原的電泳圖譜

二、免疫共沉淀純化抗原的WB分析

免疫共沉淀純化抗原的免疫印跡結(jié)果見圖2。由圖2可知，在約16 kDa處的純化抗原能被結(jié)核病患者血清抗體特異性識(shí)別，而不能被健康人血清抗體識(shí)別，表明經(jīng)免疫共沉淀篩選獲得結(jié)核病患者血清特異性識(shí)別的血清學(xué)抗原。

M：預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化抗原與結(jié)核病患者血清反應(yīng)結(jié)果；2：純化抗原與健康人群血清反應(yīng)結(jié)果圖2 免疫共沉淀純化抗原WB圖譜

三、結(jié)核分枝桿菌洗脫抗原的質(zhì)譜鑒定

切取結(jié)核病患者血清抗體識(shí)別的特異條帶，進(jìn)行串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出3種蛋白質(zhì)，分別為結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3、鐵調(diào)控Lsr2蛋白前體、糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白，鑒定結(jié)果見表1。鑒定3種蛋白質(zhì)的特異性質(zhì)譜圖分別見圖3～5。另外，在16 kDa處發(fā)現(xiàn)了41 kDa的糖基轉(zhuǎn)移酶，可能是在冰浴超聲處理抗原時(shí)蛋白質(zhì)肽鍵斷裂，鑒定的糖基轉(zhuǎn)移酶是肽鍵斷裂后形成的肽鏈。

討 論

一、Hsp16.3的生物學(xué)功能及結(jié)核病診斷研究現(xiàn)狀

抗原的選擇對(duì)結(jié)核病的血清學(xué)檢測(cè)具有關(guān)鍵作用，因此篩選出具有結(jié)核病診斷價(jià)值的抗原尤為重要。近年來，越來越多的研究表明，結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁碎片可作為引起宿主免疫反應(yīng)的蛋白抗原[7-10]。

表1 結(jié)核分枝桿菌洗脫抗原的質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的信息

注登錄號(hào)、得分、等電點(diǎn)的檢索數(shù)據(jù)庫均為NCBInr 20100724

F、Y：鑒定的肽段序列；y：C端碎片離子；b：N端碎片離子；+1：指離子峰出現(xiàn)在質(zhì)荷比數(shù)值+1所在的位置圖3 Hsp16.3 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定圖譜

A、H、R：鑒定的肽段序列；y：C端碎片離子；b：N端碎片離子；+1：指離子峰出現(xiàn)在質(zhì)荷比數(shù)值+1所在的位置圖4 鐵調(diào)控Lsr2蛋白前體蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定圖譜

A、V、M、R：鑒定的肽段序列；y：C端碎片離子；b：N端碎片離子；+1：指離子峰出現(xiàn)在質(zhì)荷比數(shù)值+1所在的位置圖5 糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定圖譜

Hsp16.3是結(jié)核分枝桿菌中存在的一類小分子熱休克蛋白，又名Hsp X，相對(duì)分子質(zhì)量為16 217，主要存在于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁上，在培養(yǎng)液中亦可見，Hsp16.3與結(jié)核分枝桿菌的感染和長(zhǎng)期潛伏密切相關(guān)，它也是結(jié)核分枝桿菌休眠期表達(dá)量增加最多的蛋白，結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞時(shí)即能刺激其大量表達(dá)，Hsp16.3在巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞本身的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生改變[11]，并加強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌菌體在巨噬細(xì)胞內(nèi)的抵抗力，Hsp16.3還能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞成熟，通過髓樣分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)和β干擾素Toll 樣受體結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF)信號(hào)通路誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12]。蘇明權(quán)等[13]研究發(fā)現(xiàn)，以Hsp16.3的ELISA檢測(cè)臨床樣品中的結(jié)核分枝桿菌抗體的敏感度為67.0%，準(zhǔn)確度為84.0%，具有潛在診斷應(yīng)用價(jià)值。Niu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Hsp16.3-Mtb10.4融合蛋白能被結(jié)核病患者和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者明顯識(shí)別，在免疫佐劑作用下產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。Zhang等[15]研究表明，Hsp16.3、ESAT6和Ag85B可作為活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染診斷的潛在生物標(biāo)志物，Weldingh等[16]重組純化了35種結(jié)核分枝桿菌蛋白，建立ELISA對(duì)結(jié)核病分析血清學(xué)反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有重組抗原中Hsp16.3能被最多的結(jié)核病患者血清抗體特異識(shí)別，成為篩選出的最重要的血清學(xué)單一抗原，其識(shí)別率達(dá)46%～98%，并維持97%的特異度；針對(duì)HIV共感染的免疫缺陷患者一般難以檢測(cè)出特異抗體的難題，研究結(jié)果顯示，Hsp16.3能識(shí)別出85%以上的HIV共感染結(jié)核病患者樣本，提示Hsp16.3可作為HIV共感染結(jié)核病的診斷重要抗原。近期，Soong等[17]對(duì)人Hsp16.3特異性抗體VH區(qū)域優(yōu)化成功，提高了抗原抗體結(jié)合親和力，為Hsp16.3抗原檢測(cè)試劑盒開發(fā)的研究提供了條件。本研究以結(jié)核病患者血清IgG篩選結(jié)核分枝桿菌菌體抗原也獲得了Hsp16.3，且能被結(jié)核病患者血清抗體特異性識(shí)別而不被健康體檢者血清抗體識(shí)別，再次證明Hsp16.3作為一種重要的血清學(xué)抗原，具有較好的血清學(xué)診斷應(yīng)用前景，為Hsp16.3在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的應(yīng)用進(jìn)一步提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

二、糖基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能和對(duì)結(jié)核病診斷的潛在應(yīng)用價(jià)值分析

糖基轉(zhuǎn)移酶具有催化生物體內(nèi)活化糖基連接到受體分子的功能，可將糖基轉(zhuǎn)移到D-N-乙酰葡糖胺分子上以形成銜接雙糖，是分枝桿菌生長(zhǎng)所必需的酶[18]。研究表明，糖基轉(zhuǎn)移酶也可能與結(jié)核病的檢測(cè)具有關(guān)聯(lián)，王爽等[19]克隆表達(dá)了阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶，并證實(shí)該蛋白能與結(jié)核病患者血清發(fā)生特異性反應(yīng)，Alvarez-Corrales等[20]在全血細(xì)胞分析試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌重組蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶作為免疫性靶抗原，能被免疫細(xì)胞識(shí)別直接引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)高水平IFN-γ的產(chǎn)生，提示糖基轉(zhuǎn)移酶可能作為一種免疫性抗原分子引導(dǎo)結(jié)核病診斷的進(jìn)一步發(fā)展。本研究在結(jié)核病患者血清篩選的抗原中也鑒定出了糖基轉(zhuǎn)移酶，由此表明，糖基轉(zhuǎn)移酶不僅具有酶的催化功能，同時(shí)作為一種蛋白質(zhì)也可能在結(jié)核分枝桿菌與感染機(jī)體相互作用中發(fā)揮免疫抗原分子的作用。

三、Lsr2蛋白的生物學(xué)功能和對(duì)結(jié)核病診斷的潛在應(yīng)用價(jià)值分析

Lsr2蛋白是一種具有組蛋白特性的DNA橋接擬核結(jié)合蛋白，通過形成核蛋白復(fù)合體在基因組的聚合與組建中發(fā)揮作用[21]。研究表明，Lsr2蛋白也是結(jié)核分枝桿菌適應(yīng)環(huán)境中氧濃度變化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，維持結(jié)核分枝桿菌在宿主內(nèi)的持續(xù)感染，是一種結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)抗原，如缺乏Lsr2蛋白，結(jié)核分枝桿菌將無法在氧濃度過高或過低的環(huán)境中存活[22]。近期，孫衛(wèi)國(guó)等[23]研究表明，體外重組表達(dá)的Lsr2蛋白能在WB試驗(yàn)中被結(jié)核病患者血清特異性抗體識(shí)別，而健康組血清沒有出現(xiàn)陽性條帶，由此推測(cè)Lsr2蛋白可能作為結(jié)核感染的一種候選靶抗原。本研究結(jié)核病患者血清篩選的抗原中也鑒定出了Lsr2蛋白，也在WB試驗(yàn)中被結(jié)核病患者血清特異性抗體識(shí)別，而健康體檢者血清抗體不能識(shí)別，與其研究結(jié)果一致，提示Lsr2蛋白可能會(huì)作為一種全新的結(jié)核分枝桿菌抗原逐漸被重視和研究。

四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)局限性分析

本研究通過免疫共沉淀偶聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩選獲得Hsp16.3、糖基轉(zhuǎn)移酶和鐵調(diào)控Lsr2蛋白前體這3種能被結(jié)核病患者血清IgG特異性識(shí)別的血清學(xué)抗原，可能具有潛在的血清學(xué)診斷價(jià)值。同時(shí)，可能因篩選抗原所用血清來自于部分結(jié)核病患者血清，其抗體水平不能代表結(jié)核病患者整個(gè)群體，尚有多種常見結(jié)核病血清學(xué)抗原未篩出，且體外篩選結(jié)核分枝桿菌抗原與體內(nèi)抗原篩選仍然存在一定差異，因此本研究可能也存在一定局限性。另外，本實(shí)驗(yàn)在16 kDa處發(fā)現(xiàn)了41 kDa的糖基轉(zhuǎn)移酶，可能是由于在制備結(jié)核分枝桿菌菌體抗原時(shí)使用了冰浴超聲法破碎菌體，而超聲處理過程中，大量的空穴氣泡可使蛋白顆粒周圍形成較大的壓強(qiáng)，促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開肽鍵斷裂，因此在16 kDa處發(fā)現(xiàn)的41 kDa的糖基轉(zhuǎn)移酶可能是糖基轉(zhuǎn)移酶肽鍵斷裂后形成的肽鏈。未來，筆者還會(huì)繼續(xù)改進(jìn)并重組表達(dá)篩選的抗原，分析其免疫診斷結(jié)核病的價(jià)值，以期為結(jié)核病的血清學(xué)診斷提供依據(jù)。