紅曲黃酒釀造過程中紅曲霉生長抑制因素初探

蔡琪琪 周康熙 劉志彬 張 晨 張 雯 倪 莉

（福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所 福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心 福州 350108）

紅曲黃酒是中國黃酒的典型代表，因添加了紅曲釀造，增加了酒體中的活性組分而備受推崇[1-2]。紅曲霉是紅曲的優(yōu)勢菌，在紅曲黃酒的釀造過程中發(fā)揮著重要作用。其一，紅曲霉作為紅曲黃酒釀造體系中的主要產(chǎn)色菌，其發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素（包括黃色素、橙色素、紅色素3大類）可以賦予紅曲黃酒特征的外觀顏色[3]；其二，紅曲霉的次級代謝產(chǎn)物（紅曲色素、莫納克林K、γ-氨基丁酸、麥角固醇等）豐富了酒體的活性成分，增加了紅曲黃酒的保健功能[4]；其三，紅曲霉強(qiáng)大的酶系能夠催化底物生成醇類、酯類、有機(jī)酸等風(fēng)味物質(zhì)，豐富了酒體的口感和芳香[5]。

由于紅曲霉對紅曲黃酒的色、香、味及保健功能等品質(zhì)做出了較為突出的貢獻(xiàn)，因此探明傳統(tǒng)釀造過程中紅曲霉的動態(tài)變化和生長機(jī)制尤為重要。黃志清等[6]、蔡琪琪等[7]的研究發(fā)現(xiàn)紅曲霉在紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程中的菌量呈不斷下降的趨勢，對其原因并未深入探究。針對紅曲霉生長的抑制因素，除了營養(yǎng)物質(zhì)的消耗之外，其它微生物的生長代謝也可能會對紅曲霉的生長產(chǎn)生影響。賈瑞博等[8]通過變性凝膠電泳技術(shù)揭示了紅曲黃酒釀造過程中的優(yōu)勢細(xì)菌為乳桿菌，發(fā)酵液酸度的增加可能會抑制紅曲霉的生長[9]；牟穰等[10]通過宏基因組學(xué)技術(shù)對海派黃酒釀造過程中真菌菌群動態(tài)進(jìn)行跟蹤測定，試驗(yàn)結(jié)果表明曲霉屬的相對豐度隨釀造時間的延長有所下降，并指出影響其變化的原因可能與酸度、酒精度的增加有關(guān)。有學(xué)者表明，紅曲黃酒釀造過程中pH值的變化在3.5～5.5范圍內(nèi)[11]，此酸度適宜紅曲霉的生長繁殖[12]，且適宜濃度的酸、醇能夠促進(jìn)高溫型紅曲霉的生長[13]。此外，釀造過程中的其它因素亦可能對紅曲霉產(chǎn)生影響，這使得紅曲霉與其生長抑制因素之間的關(guān)系變得復(fù)雜。

為探明紅曲黃酒釀造過程中紅曲霉的主要抑制因素，本研究將采用分子生態(tài)學(xué)PCR-DGGE技術(shù)及實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，對平湖紅曲黃酒釀造過程中的真菌菌群動態(tài)進(jìn)行定性、定量分析，并根據(jù)紅曲霉菌量不斷減少的趨勢推測其中可能的原因，同時構(gòu)造相應(yīng)的體系進(jìn)行驗(yàn)證，尋找影響紅曲霉生長的關(guān)鍵因子，為探究紅曲霉在發(fā)酵過程中的作用機(jī)制以及改善紅曲黃酒的品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平湖紅曲（Q01），福建省古田縣平湖紅酒曲有限公司；紅曲霉C1，由平湖紅曲中分離純化而得，編號C1，由福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所保藏[14]。圓糯米，福州市閩侯縣上街鎮(zhèn)糧油站；真菌基因組提取所需試劑、引物、PCR試劑盒、DNA Maker，上海生物工程有限公司；其它試劑均為分析純級。

糯米培養(yǎng)基：用于液化液的制備；糯米和水按質(zhì)量比1∶1.5的比例混合，在室溫下浸泡8 h，121℃蒸煮20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD型超凈工作臺，上海博訊實(shí)業(yè)；GNP-9080型恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏；BIO-RAD DcodeTM型梯度變性凝膠電泳，美國伯樂公司；瓊脂糖水平板電泳儀，北京六一公司；JS-380C型凝膠成像分析儀，上海培清；7890A氣相色譜儀，安捷倫。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 平湖紅曲黃酒釀造及取樣過程 將糯米浸泡蒸熟攤涼后，與研磨浸泡后的平湖紅曲（Q01）攪拌均勻，放入滅菌后的酒壇中，25℃糖化5 d，再調(diào)整溫度為18℃，密封發(fā)酵25 d。紅曲與糯米按質(zhì)量比1∶10添加，糯米與水添加比例為質(zhì)量比1∶1.5。取樣時間點(diǎn)設(shè)置為發(fā)酵前期（第1～7天）、中期（第 10 天）、后期（第 20、30 天）。

1.3.2 發(fā)酵樣品預(yù)處理 發(fā)酵樣品攪拌均勻后，取2.00 g，稱于20 mL無菌生理鹽水中，振蕩均勻后分裝于2 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，棄上清后，沉淀放置-20℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 孢子懸浮液的制備 紅曲霉C1活化結(jié)束后，用孢子洗脫液洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩，充分打散孢子，用4層無菌擦鏡紙過濾去除菌絲，利用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，制成終濃度為106個/mL的均一孢子懸液，備用。

1.3.4 各體系紅曲霉菌量變化的跟蹤方法 樣品真菌基因組DNA的提取及實(shí)時熒光定量PCR分析詳見參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.5 發(fā)酵體系的構(gòu)建 模擬傳統(tǒng)：30 g蒸熟糯米、3 g紅曲和45 mL無菌水，三者的質(zhì)量比與酒壇釀造一致。

純菌發(fā)酵：30 g蒸熟糯米、3 mL純菌紅曲霉（C1）菌液，補(bǔ)水至與模擬傳統(tǒng)體系同體積。

體系1（除去曲米）：30 g蒸熟糯米、紅曲處理上清液（3 g紅曲研磨后加生理鹽水充分振蕩，靜置分層，取上清液加入），補(bǔ)水至與模擬傳統(tǒng)體系同體積。

體系2（抑制因子）：30 g蒸熟糯米、無菌的紅曲處理上清液（3 g紅曲研磨后加生理鹽水充分振蕩，靜置分層，取上清液用0.22 μm的無菌濾膜過濾）、3 mL純菌紅曲霉（C1）菌液，補(bǔ)水至與模擬傳統(tǒng)體系同體積。

體系3（不同酒精度）：30 g蒸熟糯米、3 mL純菌紅曲霉（C1）菌液、不同體積的乙醇，補(bǔ)水至與模擬傳統(tǒng)體系同體積，最終乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別為0，4%，13%，16%，25%，50%。

以上均在100 mL的錐形瓶中30℃下培養(yǎng)。

1.3.6 酒精度的測定 采用填充柱氣相色譜法[15]。

（1）色譜條件 色譜柱：10%PEG填充柱；載氣：N2；進(jìn)樣量：1 μL；空氣流速：0.2 MPa；H2流速：0.05 MPa；載氣流速：0.3 MPa；氣化室溫度：230℃；柱溫：80℃；檢測器溫度：250℃。

（2）標(biāo)曲的繪制 吸取無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0，1.0000，1.5000，2.0000，2.5000，3.0000，4.0000 g/L的乙醇工作液，同時配制2.0000 g/L的正丙醇標(biāo)準(zhǔn)液，分別將各質(zhì)量濃度的乙醇工作液與正丙醇標(biāo)準(zhǔn)液等體積混合后進(jìn)樣，每個樣品重復(fù)2次，得到各質(zhì)量濃度的乙醇工作液與正丙醇標(biāo)準(zhǔn)液的峰面積比Ai/As，以標(biāo)樣的峰面積比值的平均值為橫坐標(biāo)，乙醇的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 平湖紅曲黃酒釀造過程中優(yōu)勢真菌菌群的變化

2.1.1 優(yōu)勢真菌菌群結(jié)構(gòu)分析 以NS1/GCFung作為引物擴(kuò)增平湖紅曲黃酒各個釀造時間點(diǎn)所提真菌基因組的18S rDNA序列可變區(qū)，所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析。

在DGGE圖譜（圖2）中，平湖紅曲（泳道Q01）檢測到一條高亮條帶（Band 2），而平湖紅曲黃酒釀造過程中具有處于不同位置的2個高亮條帶（Band 1和Band 2），說明Band 2對應(yīng)的菌株在平湖紅曲中屬于優(yōu)勢菌，并且Band 1對應(yīng)的菌株也存在于平湖紅曲中，并非優(yōu)勢菌，其提取效率低，因此Band 1在Q01泳道中條帶不明顯。

以純菌釀酒酵母NY02（Saccharomyces cere-visiae）及純菌紅曲霉 B1（Monascus sp.）的DGGE條帶作為參照，發(fā)現(xiàn)Band 1和Band 2分別與兩純菌條帶處于同一位置，結(jié)合前期對平湖紅曲的真菌菌群結(jié)構(gòu)分析[21]，可以確定平湖紅曲黃酒釀造過程中的優(yōu)勢真菌主要是釀酒酵母和紅曲霉，說明平湖紅曲在進(jìn)行傳統(tǒng)釀造過程中，與其它黃酒體系相比，真菌體系較為簡單[16]。

圖1 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ethanol content

此外，觀察釀造過程中的菌群動態(tài)變化，發(fā)酵前3 d，紅曲霉為絕對優(yōu)勢菌，至發(fā)酵第4天后，酵母菌對應(yīng)的條帶逐漸變亮，紅曲霉對應(yīng)的條帶逐漸變暗，甚至幾乎消失，酵母逐漸取代紅曲霉作為釀酒的優(yōu)勢菌，可能與釀造過程中的環(huán)境變化有關(guān)，也可能與兩者生長周期和生長能力不同有關(guān)[17]。

通過DGGE的定性分析可知，平湖紅曲黃酒釀造過程中的優(yōu)勢菌為紅曲霉和釀酒酵母，欲探知兩種優(yōu)勢菌的菌群數(shù)量變化，還需結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對其進(jìn)行定量追蹤。

2.1.2 優(yōu)勢真菌菌群數(shù)量變化 采用特異性引物Mp-F/Mp-R和SC1d/SC1r分別對平湖紅曲黃酒各個釀造時間點(diǎn)的紅曲霉和釀酒酵母菌量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示：兩種優(yōu)勢菌的變化趨勢與DGGE結(jié)果相符，釀酒酵母在發(fā)酵前期基本檢測不到，到第2天之后迅速增加，至發(fā)酵第5天達(dá)到5.51log10CFU/g，之后呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢。紅曲霉的數(shù)量變化則與之相反，發(fā)酵第一天則迅速下降至4.62log10CFU/g，之后在整個發(fā)酵過程中呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，在發(fā)酵第10天后下降明顯。

圖2 平湖紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)PCR-DGGE圖譜Fig.2 PCR-DGGE profiles of fungal community during the traditional brewing of Pinghu Hongqu glutinous rice wine

由于第0天和發(fā)酵過程中的取樣方法的差異可能導(dǎo)致發(fā)酵第1天的菌量迅速下降。第0天是對紅曲進(jìn)行直接取樣處理，而整個發(fā)酵過程的取樣是對酒壇里的酒醅（曲米混合樣）進(jìn)行取樣處理，樣品狀態(tài)不一致，對菌量測定結(jié)果有一定差異。然而，在發(fā)酵過程中，操作一致的情況下，紅曲霉的菌量仍然緩慢下降，釀酒酵母則穩(wěn)步上升。針對紅曲霉菌量下降的可能原因有：（1）紅曲霉與釀酒酵母之間存在拮抗作用，釀酒酵母的生長抑制了紅曲霉菌量的增加。然而，有部分學(xué)者研究表明，上述兩種菌可以互利共棲，產(chǎn)生協(xié)同作用。Shin等[18]研究表明紅曲霉與釀酒酵母純菌株混合培養(yǎng)時，紅曲霉的生物量會增加至原來的兩倍左右。周學(xué)勤等[19]研究發(fā)現(xiàn)酵母菌的添加并不會影響紅曲霉生長曲線的基本模式，酵母菌及其細(xì)胞破碎液還可以提高紅曲霉的色素產(chǎn)量，因此二者相互抑制的可能性不大。（2）紅曲霉為好氧菌，由于傳統(tǒng)釀造過程中，從發(fā)酵第6天開始封罐壇，溶氧量的減少抑制了紅曲霉的生長。（3）紅曲米對紅曲霉的物理性束縛阻礙了紅曲霉的生長和釋放。紅曲本身是在蒸熟的大米上接種紅曲霉發(fā)酵制備而得，紅曲霉菌絲深入到曲米中，生長空間有限，則在發(fā)酵過程不易被釋放出來。（4）紅曲浸泡液中可能存在某些生長抑制因子，抑制了紅曲霉的生長。（5）發(fā)酵過程中乙醇含量迅速增加，超過了紅曲霉的耐受能力，導(dǎo)致紅曲霉的生長受到抑制。

基于此，試驗(yàn)將采用小體系的研究方法對紅曲霉菌量減少的原因進(jìn)行細(xì)化探究。在進(jìn)行小體系探究時，除了發(fā)酵條件應(yīng)與傳統(tǒng)釀造保持一致，還需要通過試驗(yàn)說明紅曲霉能夠在小體系的糯米基質(zhì)上生長，且小體系對于傳統(tǒng)發(fā)酵的模擬能夠重現(xiàn)紅曲霉的生長變化規(guī)律，這樣小體系的構(gòu)建才有意義。

2.2.1 模擬體系的構(gòu)建 采用小體系研究方法，利用三角瓶替代傳統(tǒng)酒壇進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過程中紅曲、糯米及水的比例均與酒壇釀造一致，糖化時間、密封時間、發(fā)酵溫度等均嚴(yán)格模擬傳統(tǒng)發(fā)酵。

模擬傳統(tǒng)體系與傳統(tǒng)發(fā)酵體系相比，雖然在物質(zhì)傳遞、群體感應(yīng)、菌株拮抗、容器滲氧效果等方面可能有所不同[20]，但結(jié)合圖3、圖4可以發(fā)現(xiàn)，模擬傳統(tǒng)的紅曲霉菌量緩慢下降，與酒壇釀造的變化趨勢頗為相似，說明模擬傳統(tǒng)體系中紅曲霉的變化趨勢重現(xiàn)性較好，體系構(gòu)建較為合理，便于后續(xù)研究。

2.2 紅曲霉的生長抑制因素探究

圖3 釀造過程優(yōu)勢真菌的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of dominant fungal species during fermentation process

另外，在純菌發(fā)酵體系中，紅曲霉的菌量逐步增加，說明紅曲霉可以依附于糯米基質(zhì)上生長，并且第6、7天的封壇發(fā)酵對紅曲霉的生長抑制并不顯著，可見在封壇前期溶氧量的暫時減少并不是影響紅曲霉生長的關(guān)鍵因子，發(fā)酵體系內(nèi)殘余的氧氣仍能促進(jìn)紅曲霉的生長繁殖。

針對模擬傳統(tǒng)（混菌發(fā)酵）和純菌發(fā)酵體系中紅曲霉菌量變化的差異，以下將在小體系的基礎(chǔ)之上分別構(gòu)造體系以尋找影響紅曲霉生長的關(guān)鍵因子。

圖4 模擬傳統(tǒng)與純菌發(fā)酵體系中紅曲霉菌量變化Fig.4 Dynamic changes of Monascus in two systems（simulation tradition system and pure fungus fermentation system）

2.2.2 曲米的物理束縛對紅曲霉生長的影響 體系1是在模擬傳統(tǒng)的基礎(chǔ)之上，將紅曲米進(jìn)行破碎，提取紅曲米中的菌株進(jìn)行混菌發(fā)酵。解除了曲米的物理束縛后，紅曲霉的菌量仍然逐漸減少（圖5），說明曲米的物理狀態(tài)并不會對紅曲霉的生長起到明顯的抑制作用。這可能由于紅曲米在制備過程中，將糯米進(jìn)行蒸煮后，有利于米粒中的游離水與淀粉發(fā)生反應(yīng)，使其糊化，而在糊化過程中，水分子進(jìn)入微晶結(jié)構(gòu)，打破了淀粉分子之間的聯(lián)系，使淀粉分子通過水合過程形成膠體體系[21]，該體系的硬度明顯降低，減少了曲米中微生物生長的機(jī)械阻礙。而曲米中的微生物在生長繁殖過程中，會降解糊化體系中的淀粉，拓寬了微生物的生長空間，干燥后使曲米形成多孔結(jié)構(gòu)，減少了曲米的物理束縛，因而對紅曲霉生長的影響較不顯著。

2.2.3 曲米浸泡液對紅曲霉生長的影響 在紅曲米的制備及貯存過程中，曲米內(nèi)部和表面微生物分泌的代謝產(chǎn)物可能會對紅曲霉的生長產(chǎn)生影響，為探究此影響，構(gòu)建了體系2。該體系在純菌發(fā)酵的基礎(chǔ)上加入了無菌紅曲處理液，如圖6所示。結(jié)果表明，體系2的生長曲線與圖4中的純菌發(fā)酵體系類似，紅曲霉的菌量穩(wěn)步增加，可見曲米浸泡液中的物質(zhì)在發(fā)酵過程中對紅曲霉的生長抑制并不顯著，可能由于微生物在生長過程中會通過代謝作用來改變生長環(huán)境，從而利于它自身的生長，而DEEG和qPCR的結(jié)果均顯示紅曲霉為紅曲米中的優(yōu)勢菌，曲米中積累的物質(zhì)難以對紅曲霉產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響。

圖5 體系1中紅曲霉的菌量變化Fig.5 Dynamic changes of Monascus in system one

2.2.4 酒精度對紅曲霉生長的影響 構(gòu)建體系3，研究酒精度對紅曲霉生長的影響。如圖7所示，空白組（KB）和4%酒精度樣品組①的糯米上都能布滿菌絲，而隨著乙醇濃度的增加，糯米培養(yǎng)基上的紅色菌絲逐漸減少，表明酒精度的增加對紅曲霉的生長有明顯的抑制作用。

圖6 體系2中紅曲霉的菌量變化Fig.6 Dynamic changes of Monascus in system two

圖7 體系3中不同酒精度下紅曲霉的生長情況Fig.7 The growth of Monascus under different alcohol content

試驗(yàn)進(jìn)一步對傳統(tǒng)釀造過程中酒精度的變化與紅曲霉生長的關(guān)系進(jìn)行細(xì)化研究。根據(jù)傳統(tǒng)酒壇釀造過程中酒精的變化情況（圖8），將各個取樣時間點(diǎn)對應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇加入帶有紅曲霉C1孢子液的糯米培養(yǎng)基中，單獨(dú)發(fā)酵3 d，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，單獨(dú)發(fā)酵第1天紅曲霉的菌量就出現(xiàn)明顯差異，分別聚集在3個位置：（1）KB和傳統(tǒng)發(fā)酵第1～3天的酒精度對應(yīng)的紅曲霉菌量最多，且在后續(xù)發(fā)酵中基本持平，說明酒精度低于4%時，對紅曲霉的生長無影響；（2）傳統(tǒng)發(fā)酵第4～5天的酒精度（9%，12%）對應(yīng)的紅曲霉菌量居中，且在后續(xù)發(fā)酵中持續(xù)上升至與KB相當(dāng)，有研究表明紅曲霉可以耐受10%左右的乙醇[22]，說明此時的酒精度已臨近紅曲霉的耐受范圍，紅曲霉的生長開始受到抑制；（3）傳統(tǒng)發(fā)酵第6～30天的酒精度，這些酒精度下對應(yīng)的紅曲霉菌量最少，且在后續(xù)發(fā)酵中，第6～10天的酒精度下紅曲霉菌量迅速增加，而發(fā)酵第20～30天的酒精度下紅曲霉的菌量則增加緩慢，抑制作用更明顯，該結(jié)果與DGGE圖譜的菌量變化相一致，即紅曲霉的條帶在發(fā)酵第20天明顯變淡。

圖8 發(fā)酵過程中乙醇的含量變化Fig.8 Changes of ethanol content during the fermentation process

圖9 傳統(tǒng)釀造中的酒精度變化對紅曲霉生長的影響Fig.9 Effect of alcohol content during traditional brewing on the growth of Monascus

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明傳統(tǒng)釀造體系的優(yōu)勢真菌為釀酒酵母和紅曲霉，其中紅曲霉在發(fā)酵前3 d占優(yōu)勢，之后其菌量逐漸下降，而釀酒酵母在發(fā)酵第3天后逐漸增加，并隨著發(fā)酵時間的延長逐步取代紅曲霉成為釀造中后期的優(yōu)勢菌。在模擬傳統(tǒng)和純菌發(fā)酵過程中，模擬傳統(tǒng)體系可以重現(xiàn)紅曲霉的生長趨勢，而純菌發(fā)酵體系說明了封壇前期溶氧量的暫時減少并不能顯著抑制紅曲霉的生長。根據(jù)前期的對比研究，初步推測紅曲米的物理束縛、紅曲浸泡液中的物質(zhì)以及酒精度的增加可能會抑制紅曲霉生長，針對這3個可能的影響因素構(gòu)造3種體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前兩者對于紅曲霉的生長并不會起到顯著的抑制作用，而酒精度的增加是影響紅曲霉生長的關(guān)鍵因子。試驗(yàn)進(jìn)一步對傳統(tǒng)釀造過程中酒精度的變化與紅曲霉生長的關(guān)系進(jìn)行深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期的酒精度（體積分?jǐn)?shù)0～4%）對紅曲霉無影響，而隨著酒精度的增加，紅曲霉的生長逐漸受到抑制，至發(fā)酵后期的酒精度（體積分?jǐn)?shù)17%）對紅曲霉的抑制作用顯著，因而導(dǎo)致紅曲霉在DGGE上的條帶在發(fā)酵第20天明顯變淡。