劉 玲 唐仕成 柯皓天 呂 銀

(1. 四川省絲綢工程技術研究中心， 成都 610031；2. 四川省絲綢科學研究院， 成都 610031)

PCR的退火溫度與引物長度、堿基組成和引物濃度有關，ISSR引物的退火溫度差異很大是ISSR-PCR反應的突出特點。對于長度低于20bp的引物，Tm值可以按Tm=4(G+C)+2(A+T)計算，ISSR引物一般少于20bp，適用于該公式[1]。但是在實驗過程中，往往根據Tm值得不到清晰穩(wěn)定的擴增條帶，因此在正式實驗之前，有必要確定每個ISSR引物的最適退火溫度。

本試驗在已篩選出桑樹ISSR-PCR最佳反應體系的基礎上，對適合桑樹體系的5條ISSR引物的最佳退火溫度進行篩選，以優(yōu)化ISSR標記技術在桑樹遺傳多樣性方面的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料采自四川省絲綢科學研究院桑樹種質資源圃。

擴增引物參考加拿大英屬哥倫比亞大學UBC公司2006年公布的ISSR引物序列和已有的ISSR分子標記在桑樹方面的應用研究結果[2]，從42條引物中篩選出5條引物(表1)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×Buffer均購自TaKaRa。

1.2 基因組DNA提取及質量檢測

基因組DNA提取參照CTAB法，從約0.15g硅膠干燥的嫩桑葉中提取。DNA質量用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，濃度用微量紫外分光光度計檢測確認。

1.3 ISSR-PCR擴增

PCR反應在Thermal Cycler(上海山富科學儀器有限公司)上進行。反應體系(總體積10 μL)：25ng模板1μL、10×Buffer 1μL、20μmol/L引物0.2μL、2.5mM Mg2+0.8μL、2.5mM dNTPs 1μL、5U/μL rTaq 0.1μL，加ddH2O 至10μL。

反應程序為：94℃預變性5min，94℃變性40s，合適的退火溫度退火45s，72℃延伸90s，40個循環(huán)，72℃延伸10min，16℃保存。

PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖電泳檢測，電壓250V，電流150mA，電泳20～25min，在紫外透射反射儀下觀察拍照保存。

1.4 引物退火溫度梯度設置

以確定的最佳反應體系為基礎，根據引物Tm值設置退火溫度梯度范圍為Tm±5℃，PCR儀自動生成12個溫度。PCR擴增后產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據擴增結果確定引物的最適退火溫度。每個退火溫度擴增設兩個重復。

表1 引物信息

Y=(C, T) R=(A, G) V=(A, C, G) H=(A, C, T)

2 結果與分析

2.1 引物退火溫度的確定

根據擴增條帶是否清晰和檢測到的位點數的多少兩個方面來確定引物的最佳退火溫度。引物ID8擴增效果如圖1所示，退火溫度為51.1℃時，兩個重復的擴增條帶一致、清晰、穩(wěn)定；退火溫度低于51.1℃時，雜帶增多，且出現兩個重復的擴增條帶不一致的情況；退火溫度高于51.1℃時，擴增條帶減少，同樣存在兩個重復的擴增條帶不一致的現象。因此，引物ID8的最佳退火溫度應選擇51.1℃。本研究中5條引物的最適退火溫度見表2。

圖1 引物ID8退火溫度篩選

引物名稱溫度梯度/℃Tm值/℃最適退火溫度/℃ID541.2,41.5,42.4,43.7,45.2,46.7,48.2,49.7,51.2,53.344.643.7ID846.1,47.2,48.5,49.8,51.1,52.4,53.8,54.9,55.750.251.1ID1047.7,48.8,50.0,51.4,52.8,54.3,55.7,57.1,58.3,59.252.859.2ID1246.1,47.2,48.5,49.8,51.1,52.4,53.8,54.9,55.750.849.8ID4248.8,50.0,51.4,52.8,54.3,55.7,57.1,58.3,59.2,59.554.358.3

2.2 引物Tm值與最適退火溫度擴增效果差異分析

如圖2所示，引物ID10的Tm值為52.8℃，在此溫度條件下，擴增條帶數量少且不清晰，并不是最優(yōu)結果，而且與試驗得到的最佳退火溫度59.2℃相差6.4℃，由此可見，引物的Tm值和最佳退火溫度之間，不存在明顯相關性。

M： Marker

3 討論

退火溫度不同，產生錯配的程度不同。較低的退火溫度，能提高引物與模板結合的穩(wěn)定性，但會產生一些非特異擴增。較高的退火溫度能保證特異性擴增，但過高的溫度會抑制引物與模板的結合。當在幾個退火溫度下擴增效果差異不大時，應選擇較高的溫度作為引物的退火溫度。本實驗過程中，也出現了部分引物(如ID10)，退火溫度越高條帶越多的情況，這需要重新調整溫度梯度范圍來尋找最佳退火溫度。同時，本研究還發(fā)現引物的Tm值與其最適退火溫度之間，沒有明顯相關性。因此在具體研究中，每條引物的最適退火溫度需要通過實驗獲得，而不能僅靠理論推算獲得。

目前，在優(yōu)化ISSR體系的研究中，多采用設置溫度梯度確定最佳退火溫度。這種方法受到PCR儀自動生成溫度的限制，對一些特異性較差的引物效率較低。例如，本實驗用到的Thermal Cycler，設置溫度梯度時，第1與第2溫度點只差0.2℃，第11和第12溫度點只差0.3℃，中間第3到第10溫度點，每兩個溫度點之間相差約1.0℃，得到的擴增結果只能代表10個退火溫度的情況。

劉麗麗等[3]采用梯度溫度PCR和降落PCR相結合，優(yōu)化東南石櫟的ISSR-PCR反應體系，經比較在最適退火溫度下，ISSR擴增結果與降落PCR的擴增效果差異不大，由于降落PCR不需要額外進行退火溫度的確定，具有明顯的便利性，最終采用了降落PCR進行東南石櫟的ISSR分析。這種方法給桑樹的ISSR分析提供了借鑒。