Beclin1與UCH-L5及LC3在急性髓系白血病中的表達及作用研究

苗玉迪 李艷春 李慶瑞

急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)是1種源于造血干細胞癌變的疾病，具有治療困難，容易復(fù)發(fā)的特點，當前預(yù)后因素對AML根據(jù)進行分型以便于進行個性化治療，可分為低危、中危、高危三種，治療方法通常為先采取誘導(dǎo)化療使病情達到完全緩解后再行進一步化療或骨髓移植。AML的致病原因復(fù)雜至今尚未完全清楚，可能同遺傳學和環(huán)境因素的作用有關(guān)[1-3]。自噬是細胞清除問題蛋白質(zhì)和細胞器的過程，具體為用囊泡包裹細胞中問題蛋白或細胞器，然后與溶酶體融合成為自噬溶酶體，逐漸降解內(nèi)部物質(zhì)。自噬能產(chǎn)生細胞代謝所需的部分物質(zhì)[4]。自噬在不僅存在于機體正常生理過程中，在病患時期也可見，其對癌癥的發(fā)展所起的作用尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，自噬與白血病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切，大多數(shù)白血病細胞中自噬能力都會發(fā)生變化。研究表明自噬現(xiàn)象存在于白血病患者骨髓中，自噬缺陷可能可能是骨髓增生異常綜合征MDS向AML進展的發(fā)生機制[5-6]。自噬是由多種基因調(diào)控，自噬相關(guān)基因Beclin1是自噬形成過程中的可能1種重要的調(diào)控因子，在自噬的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。去泛素化酶UCH-L5是泛素蛋白酶UPS家族一員，研究顯示，其同某些腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，UPS是除了自噬以外的真核生物的另1種蛋白降解方式。微管相關(guān)蛋白LC3參與自噬體的形成，起定位于自噬泡和自噬泡膜表面[8]。 LC3是標記自噬體的特異性蛋白，其的表達強度與細胞自噬活性關(guān)系緊密。目前在急性髓系白血病中，自噬的發(fā)揮的作用及其機制尚不明確[9]。本研究擬通過分析AML患者的Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達情況，探究自噬同AML的關(guān)系，為診斷及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年2月至2018年2月在本院診斷和治療AML患者80例，劃分為AML初發(fā)組和緩解組，初發(fā)組40例，男性22例，女性18例，年齡18～73歲，平均年齡36.7歲；緩解組40例，男性21例，女性19例，年齡21～68歲，平均年齡39.45歲。另選取健康體檢患者40例，男性19例，女性21例，年齡24～70歲，平均年齡37.74歲。AML納入標準：經(jīng)臨床、血液學、骨髓細胞形態(tài)檢測，參照《血液病專斷及療效標準》確診為AML患者，骨髓形態(tài)學正常；排除標準：患有腫瘤、感染等嚴重疾病，處于妊娠或生理期女性，臨床病歷資料不全者。研究前向患者詳細介紹研究內(nèi)容，患者簽署知情同意書，研究獲得了本院倫理委員會的批準，三組患者年齡、性別等一般資料無統(tǒng)計學差異。

1.2 主要試劑及儀器

PBS液，淋巴細胞分裂液(上海博升生物科技有限公司)，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素，自噬抑制劑3-MA，化療藥物阿糖胞苷，離心機(美國Sigma公司),ABI-Prism7500 實時熒光定量PCR儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 測定各組基因表達 獲取健康組、初發(fā)組、緩解組患者脊髓液，抗凝保存。將HL-60細胞分為對照組，自噬誘導(dǎo)劑組、自噬抑制劑組、治療組，在IMDM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，各自加入100 nmol/l自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA、化療藥物阿糖胞苷，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。RT-PCR檢測以上各組Beclin1、UCH-L5、LC3的mRNA表達情況。

1.3.2 RT-PCR檢測方法 提取RNA。獲取各組患者骨髓液，并與-80 ℃存放備用。取骨髓液、HL-60細胞培養(yǎng)液各2 ml，經(jīng)抗凝，PBS液處理，加細胞分裂液，經(jīng)離心機作用分離單個核細胞，提取總RNA，于-80 ℃存儲。逆轉(zhuǎn)錄。①合成引物機探針。從GeneBank獲取ERG、MDR1、BAALC基因堿基序列，應(yīng)用primer express 3.0設(shè)計引物及探針，各組基因以GAPD作為內(nèi)參，內(nèi)參基因探針及上下游引物:Beclin1上游為5'-GAAGACACAGGAGGCAGT-GG-3',下游為5'-AGGACACCCAAGCAAGACC-3'。UCH-L5上游5'-GGGTCTTCACCGAGiCTCATTA-3'UCH-L5下游5'-AAGTCGGGAGTCCTGAACCA-3'LC3上游5'-AAACGCATTTGCCATCACA-3'LC3下游5'-GGACCTTCAGCAGTTTACAGTCAG-3'。GAPDH上游5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'GAPDH下游5'-TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。②構(gòu)建熒光定量PCR標準模板。③ 使用MJ 9700PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR反應(yīng)測定表達值。使用ABI 7500全自動熒光定量PCR儀 (美國ABI公司)進行PCR反應(yīng)，生成結(jié)果并分析計算。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，隨后40個循環(huán)，94 ℃變性15 s,60 ℃延伸60 s，自動收集熒光，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、觀察、照相后獲取結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 不同危險度分級Beclin1、UCH-L5、LC3表達

結(jié)果顯示Beclin1、UCH-L5、LC3在 AML患者中增強，并隨危險度分級升高而升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同危險度分層患者的Beclin1、UCH-L5、LC3 mRNA表達

2.2 不同治療階段Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

結(jié)果顯示Beclin1、UCH-L5、LC3在初發(fā)組中表達增強，并隨危險度分級升高而升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在緩解組表達較初發(fā)組減弱(P<0.05)，見表2。

表2 不同治療階段Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

注：初發(fā)組與健康組、緩解組比較，P<0.05；緩解組與對照組比較，P>0.05。

2.3 自噬誘導(dǎo)劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

自噬誘導(dǎo)劑作用后，誘導(dǎo)劑組與對照組比較，beclin1表達增強，UCh-L5基因表達減弱調(diào)，LC-3表達增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 自噬誘導(dǎo)劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

2.4 自噬抑制劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

自噬抑制劑作用后，抑制劑組同對照組比較，beclin1表達減弱，UCh-L5基因表達增強，LC-3表達減弱，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 自噬抑制劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

2.5 阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

治療AML藥物處理后 AML治療組同對照組比較Beclin1表達增強，UCH-L5減弱，LC3增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

3 討論

自噬是從酵母到哺乳動物的真核細胞均存在的現(xiàn)象，是1個把變性的蛋白質(zhì)、細胞器通過溶酶體通路降解的重要細胞過程，在應(yīng)激條件下，自噬能為細胞提供能量，維持細胞生存[10]。自噬功能具有兩面性，一方面誘導(dǎo)自噬可抑制腫瘤生長，導(dǎo)致自噬相關(guān)細胞死亡，另一方便，自噬可為癌細胞提供營養(yǎng)，清除氧自由基、損傷的線粒體等，能一定程度上維持癌細胞生存[11-12]。自噬既能抑制癌癥又能促進癌癥的兩面性使其在癌癥不同階段發(fā)揮不同作用。自噬抑制癌癥作用表現(xiàn)在癌癥未發(fā)生時。自噬具有清除損傷的細胞器，像受損的線粒體，避免其產(chǎn)生大量自由基，為防止基因突變，預(yù)防細胞癌變做出貢獻。如果自噬能力減弱，會導(dǎo)致受損DNA數(shù)量升高，直接增加了癌癥發(fā)生的風險[13-14]。在癌癥起始階段，自噬功能通常被抑制，以減弱其抑制癌癥的能力，當癌癥已經(jīng)發(fā)生時，自噬憑借其獨特能力，為維持癌細胞生存提高幫助。在化療藥物和放療等應(yīng)激條件刺激下，癌細胞的自噬水平明顯升高以維持癌細胞生存，在癌癥晚期，自噬活動活躍，可能增加癌癥細胞耐藥性。因此，自噬可能是癌癥的一個治療靶點，有研究顯示自噬抑制劑聯(lián)合mTORCl抑制劑可作為AML的靶向治療藥物[15]。

Beclin1基因近年來被認為是重要的誘導(dǎo)自噬因子，主要作用于自噬啟動階段，是介導(dǎo)其他自噬相關(guān)蛋白準確定位的關(guān)鍵因子，直接參與自噬調(diào)控過程，是潛在的腫瘤抑制基因[16-17]。本研究顯示，Beclin-1基因AML患者中較對照組較健康組和緩解組比較呈現(xiàn)出高表達，同AML的危險度分級呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，這同自噬在癌癥不同階段的作用是相符的，也驗證了自噬在AML中發(fā)揮了作用，說明Beclin-1同AML預(yù)后存在關(guān)聯(lián)?？赡茉蚴怯捎诎┳兗毎媾R更高的代謝壓力，腫瘤細胞為應(yīng)對營養(yǎng)缺乏，通過Beclin-1提高自噬水平來維持其存活，在在治療后達到完全釋解后，也恢復(fù)到正常表達。UCH-15是去泛素化酶UCH家族的主要成員，同時也屬于泛素-蛋白酶系統(tǒng)。泛素-蛋白酶體通路主要發(fā)揮和終結(jié)基因和蛋白質(zhì)功能，該通路調(diào)控著包括細胞的增殖、分化、凋亡，蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制、降解，基因的轉(zhuǎn)錄、修復(fù)等幾乎所有動植物的生命活動[18-19]。本研究中UCH-L5在AML治療的不同階段表達不同，不同危險度分層中表達存在差異，說明UCH-L5同AML預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。LC3定位于自噬泡膜表面和前自噬泡，參與自噬體的形成，包括Ⅰ型和Ⅱ型兩種類型。未發(fā)生自噬時，細胞內(nèi)存在的是胞質(zhì)可溶性的Ⅰ型LC3，表達正常。自噬發(fā)生時，Ⅰ型LC3與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合轉(zhuǎn)化為Ⅱ型 LC3，表達增強。LC3始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，鑒于其含量與自噬泡數(shù)量相對應(yīng)，LC3成為了自噬的標志性基因[20]。本研究中，LC3表現(xiàn)了同Beclin1一致的表達現(xiàn)象，清晰的現(xiàn)實了自噬在AML中發(fā)揮了作用，也說明LC3同AML預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。

本研究中，經(jīng)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA和AML化療藥物阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3的基因表達均呈現(xiàn)出明顯變化，差異具有統(tǒng)計學意義，其中Beclin1、LC3作為自噬相關(guān)基因，表現(xiàn)一致，在誘導(dǎo)劑和化療藥物作用下表達增強，而在抑制劑作用下表達減弱，說明可以通過藥物實現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬的水平的目的。而化療藥物阿糖胞苷導(dǎo)致自噬標志物升高，推測可能是由于藥物對癌細胞造成了很大損傷，短期內(nèi)誘發(fā)癌細胞增強自噬機制進行抵抗。UCH-L5的表達變化說明自噬抑制劑和誘導(dǎo)劑以及化療藥物可影響UCH-L5的表達，推測UCH-L5同自噬機制存在一定關(guān)聯(lián)。

綜上，可見Beclin1、UCH15、LC3在AML患者中呈現(xiàn)高表達，且與危險程度分級正相關(guān)，其表達同自噬過程關(guān)系密切，推測可通過藥物調(diào)節(jié)三基因表達實現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬而定目的，進而影響AML的治療。