橡子殼斗提取工藝及其抗氧化性研究

任云，朱曉敏，李明清，朱金慧，王博

（1.邯鄲學院化學化工與材料學院，河北邯鄲056005；2.武安市第一人民醫(yī)院，河北武安056300）

橡子殼斗是指櫟屬（Quercus Linn.），包括麻櫟、栓皮櫟、遼東櫟等櫟樹，果實殼斗，亦稱橡碗。橡子殼斗可提取色素并用于染色，早在明高濂《遵生八箋》中記載了制取橡子殼斗染液的方法，名為染宋箋色法：“取橡斗子一升，用四升水浸一伏時煎熬至二升止，聽用”[1]。另據(jù)《全國中草藥匯編》記載，麻櫟、栓皮櫟、遼東櫟等櫟樹植物樹皮、葉、果實、果殼、殼斗可入藥內服或外用，主要作用為收斂、止血、止瀉、止咳[2]。近期，周丹初步研究并報道了栓皮櫟殼斗及果殼提取物化學成分及其對食源性致病菌的抑菌作用，結果表明殼斗正丁醇相和乙醇相提取物對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，其次是對甲型副傷寒沙門氏菌抑制作用較強[3]。橡子殼斗資源豐富，但目前產業(yè)附加值有限。其生物活性、抗氧化性等研究鮮有報道，進一步系統(tǒng)深入的研究橡子殼斗提取工藝、化學成分及其活性，將有利于開發(fā)其在食品、藥品等方面的利用[4]，提高資源綜合利用價值。就提取工藝而言，傳統(tǒng)提取工藝輔助超聲、微波等現(xiàn)代技術可提高提取效率，郝乘儀等采用超聲輔助提取了橡子單寧，結果橡子單寧的提取率達到93.67%[5]。較于微波輔助，超聲輔助具有設備成本低、安全性高等特點，有潛在的工業(yè)化價值。本研究采用超聲輔助乙醇提取工藝提取橡子殼斗，利用響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，確定最優(yōu)工藝，同時對提取物的酸堿穩(wěn)定性和抗氧化性、總還原力進行研究，為橡子殼斗在食品或化妝品領域的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料及試劑

橡子殼斗：市售；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：新鄉(xiāng)市化學制劑廠；鐵氰化鉀：中國上海試劑一廠；三氯化鐵：北京市朝陽區(qū)通惠化工廠。其他試劑均為市售分析純。

1.1.2 試驗儀器

KQ-500DB 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；T6 紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 確定檢測波長

橡子殼斗干燥，粉碎過80 目篩，備用。稱取1 g 橡子殼斗粉，在料液比 1 ∶40（g/mL），溶劑濃度取 0 %、95%（乙醇水溶液的乙醇體積分數(shù)），提取時間40 min、提取溫度50 ℃，固定超聲功率500 W 條件下，制備殼斗提取物溶液，將提取液離心，上清液稀釋至合適濃度，在200 nm～800 nm 范圍內進行紫外光譜掃描，確定橡子殼斗提取物紫外檢測波長。

1.2.2 單因素試驗

分別精確稱取1.0 g 橡子殼斗粉，采用單因素試驗，針對影響因素料液比、溶劑濃度、提取時間、提取溫度等進行試驗。根據(jù)前期預試驗結果，提取率正比于超聲功率，因此固定超聲功率500 W，超聲功率不做為影響因素。所得提取液統(tǒng)一稀釋至1 g/L 后測定330 nm 處吸光度，考察各影響因素對橡子殼斗提取溶液吸光度的影響。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果確定Box-Behnken 設計的自變量為提取溫度、溶劑濃度、料液比，自變量取值見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Response surface test factor level

進行三因素三水平響應面優(yōu)化17 組試驗，并重復試驗3 次取平均值，其他條件同單因素試驗。根據(jù)響應面試驗結果，以得到提取液330 nm 處吸光度為響應值，采用Design expert 程序對所得數(shù)據(jù)進行處理，得到二次回歸方程和誤差分析。確定最優(yōu)工藝條件及其提取液吸光度的預測值，并進行驗證試驗[6]。

1.2.4 提取物表征

1.2.4.1 pH 值對提取液穩(wěn)定性影響

取6 份10 mL 0.3 g/L 橡子殼斗提取物配置的溶液，分別用鹽酸或氫氧化鈉將 pH 值調至 2、4、6、8、10、12，靜置60 min 后對各溶液以及對照液進行330 nm檢測波長的吸光度測定。以是否產生沉淀、嚴重褪色評價其穩(wěn)定性。

1.2.4.2 金屬離子對提取液穩(wěn)定性影響

取8 份25 mL0.3 g/L 橡子殼斗提取物配置的溶液，分別加入不同的金屬離子，K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、A13+、Fe3+，且濃度均為 0.05 mol/L，室溫 20 ℃避光放置24 h 后對各溶液以及原提取液進行紫外光譜分析。

1.2.4.3 DPPH 自由基清除能力

橡子殼斗提取物及VC，配制濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L 的溶液。

樣品組中，分別取不同濃度的橡子殼斗溶液5 mL，加入0.2 mmol/L 的DPPH 溶液5 mL，搖勻，放置于陰涼避光處，30 min 后以無水乙醇為對照，在517 nm 處測定吸光度A0[7]。VC同上。

空白組中，分別取不同濃度的橡子殼斗溶液5 mL，加入無水乙醇5 mL，以無水乙醇為對照，在517 nm 處測定吸光度A1。VC同上。

對照組中，取0.2 mmol/L 的DPPH 溶液5 mL，加入無水乙醇5 mL，以無水乙醇為對照，在517 nm 處測定吸光度A2。

按下列公式計算DPPH 自由基清除率[8]：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A0-A1）/A2]×100

1.2.4.4 總還原能力的測定

橡子殼斗提取物、VC分別配制濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L 的溶液。

分別取不同濃度的橡子殼斗溶液2.5 mL，加入0.2 mol/L pH6.6 的磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，搖勻，放置于50 ℃水浴反應，20 min后快速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，搖勻后以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，加入1 g/L的三氯化鐵溶液2.5 mL，搖勻后室溫20 ℃靜置反應，10 min 后，在 700 nm 處測定吸光度。以 VC為對照[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)響應面試驗結果，以得到提取液吸光度為響應值，采用Design expert v8.0.6 程序對所得數(shù)據(jù)進行處理，得到二次回歸方程、誤差分析和各影響因素之間交互影響圖，篩選出最優(yōu)工藝條件以及該條件下提取液吸光度預測值。

2 結果與討論

2.1 確定檢測波長

橡子殼斗提取液進行稀釋，稀釋后料液比1 g/L，在200 nm～800 nm 波段進行圖譜掃描，結果如圖1 所示。

圖1 橡子殼斗提取物全波長掃描Fig.1 Full wavelength scanning of acorn shell extract

如圖1 所示，水或乙醇提取物吸收峰均出現(xiàn)在200 nm～400 nm，且吸收曲線具有相同變化趨勢，說明兩種溶劑提取物組成相同。尤其在330nm～500nm 處，兩曲線重合，因此選用330 nm 作為檢測波長，測定殼斗提取物的吸光度，以量化提取率。

2.2 單因素試驗

2.2.1 溶劑濃度對橡子殼斗提取物溶液吸光度的影響

在固定料液比為 1 ∶40（g/mL）、提取時間為 40 min、提取溫度為50 ℃，改變溶劑濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%，結果如圖2 所示。

圖2 溶劑濃度對橡子殼斗提取物溶液吸光度的影響Fig.2 Effect of solvent concentration on the absorbance of acorn shell extract

由圖2 可知，隨著溶劑濃度增加，殼斗提取液的吸光度先增大，增大到一定值后，隨著溶度濃度的增加而減小，在溶劑濃度為50%時有最高點。溶劑濃度低，得到的橡子殼斗溶液吸光度低，即提取率低；溶劑濃度高，溶劑的極性不適合橡子殼斗的提取，得到的橡子殼斗溶液濃度低，且溶劑成本較高。因此選擇合適的溶劑濃度對橡子殼斗的提取是有利的，由此確定最佳溶劑濃度為50%。

2.2.2 料液比對橡子殼斗提取物溶液吸光度的影響

在固定溶劑濃度為50%、提取時間為40 min、提取溫度為 50 ℃，改變料液比（1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70 g/mL）條件下，結果如圖3 所示。

圖3 料液比對橡子殼斗提取物溶液吸光度的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on the absorbance of acorn shell extract

由圖3 可知，料液比增加，提取液的吸光度先增加后減小，但總體減小緩慢。當料液比在1 ∶40（g/mL）至1 ∶50（g/mL）之間時，應有最高點，因此綜合考慮溶液成本與提取效率，選取最佳料液比為1 ∶40（g/mL），既可以減少成本，避免資源浪費，又能達到最大提取率。確定響應面試驗水平料液比為1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）。

2.2.3 提取時間對橡子殼斗提取物溶液吸光度的影響

在固定溶劑濃度為50%、料液比為1 ∶40（g/mL）、提取溫度為 50 ℃，改變提取時間 20、40、60、80、100 min條件下，結果如圖4 所示。

圖4 提取時間對橡子殼斗提取物溶液吸光度的影響Fig.4 Effect of extraction time on the absorbance of acorn shell extract

由圖4 可知，提取液的吸光度隨著提取時間的增加，先增加后減少，在提取時間為40 min 有最高點。超聲輔助提取，可產生機械熱效應和空化效應，使有效成分快速擴散到溶劑中，有效減少提取時間。當提取時間過長時，超聲波可能破壞提取物結構，或可能使提取物產生團聚、絮凝使提取率降低。因此取40 min為單因素最優(yōu)水平，由于過長時間超聲的破壞作用，不選取提取時間作為響應面分析的因素。

2.2.4 提取溫度對橡子殼斗提取物溶液吸光度的影響

在固定溶劑濃度為50%、料液比為1 ∶40（g/mL）、提取時間為 40 min，改變提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）條件下，結果如圖5 所示。

由圖5 可知，隨著提取溫度增加提取液的吸光度先增加，增加到一定值后，隨著溫度的增加而減小，在溫度為70 ℃時有最高點。提取溫度過高，提取物中的某些熱敏物質可能被破壞，使得到的橡子殼斗溶液吸光度降低，具體機理有待進一步研究。綜合考慮成本與提取率，60 ℃與70 ℃提取率相差較小，確定最佳提取溫度為60 ℃。

2.3 響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應面二次回歸方程的建立與誤差分析

響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results for response surface analysis

采用Design expert 程序對表2 數(shù)據(jù)用ANOVA進行回歸分析，得到誤差分析結果及二次回歸方程見表3。

表3 響應面誤差分析結果Table 3 Variance analysis of regression model

該模型的C.V.=1.62%，C.V.值越小說明模型的置信度就越高，說明該模型的置信度高。該模型的R2adj=0.969 7、R2=0.986 7，R2和 R2adj 越接近 1，說明模型相關性越好，表明提取液吸光度的影響96.97%來源于提取溫度、溶劑濃度、料液比。該試驗模型與試驗實際過程符合程度高，模型合理可行，可用來預測試驗中橡子殼斗提取液吸光度與試驗過程各因素、各水平的相關變化關系。

吸光度=0.56-4.875×10-3×A-0.043×B-0.019×C+3.500×10-3×AB-0.020×AC+0.012×BC-0.040×A2-0.023×B2-0.035×C2

通過響應面誤差分析，該模型P＜0.000 1 為極顯著性差異，說明該模型顯著性高。其中，溶劑濃度、料液比、AC、A2、B2、C2對提取液吸光度的影響極高度顯著，其 P 值均＜0.01；BC 的影響顯著，其 P 值＜0.05；提取溫度、AB 對提取液吸光度影響不顯著，其P 值均＞0.05。且影響由大到小因素順序為：溶劑濃度＞料液比＞提取溫度。失擬誤差為0.056 5＞0.05 為不顯著，說明實驗結果影響因素都在考察范圍之內，試驗結果不受其他因素影響或可忽略[10]。

2.3.2 各影響因素交互作用

2.3.2.1 提取溫度和溶劑濃度交互作用

交互作用響應面陡峭程度越高，代表交互作用越強。圖6 為提取溫度和溶劑濃度對橡子殼斗提取物溶液吸光度交互作用結果。

圖6 提取溫度和溶劑濃度響應面曲線Fig.6 Response surface curves of extraction temperature and solvent concentration

該響應面陡峭程度為3 個交互作用中程度最低，其交互作用對提取結果影響不顯著。當提取溫度一定時，溶液吸光度隨著溶劑濃度減小緩慢增加，并逐漸趨于平緩。當溶劑濃度一定時，溶液吸光度隨著提取溫度增加，呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，且變化范圍較小。

2.3.2.2 提取溫度和料液比交互作用

圖7 為提取溫度和料液比對橡子殼斗色素提溶液吸光度交互作用結果。

圖7 提取溫度和料液比響應面曲線Fig.7 Response surface curves of extraction temperature and ratio of feed to liquid

該響應面陡峭程度為3 個交互作用中程度最高，交互作用對溶液吸光度影響顯著。當提取溫度為60 ℃、料液比為 1 ∶40（g/mL）時，吸光度最大，達提取最優(yōu)點，相對于最優(yōu)點，更高的溫度和溶劑用量較更低的溫度和溶劑用量提取率降低的更加快速，此提示橡子殼斗更適合在較少的溶劑用量下采用較低溫度進行提取。

2.3.2.3 溶劑濃度和料液比交互作用

圖8 為溶劑濃度和料液比對橡子殼斗提取物溶液吸光度影響的交互作用結果。

圖8 溶劑濃度和料液比響應面曲線Fig.8 Response surface curves of solvent concentration and ratio of feed to liquid

該響應面陡峭程度為3 個交互作用的中間程度，交互作用對溶液吸光度影響顯著。當溶劑濃度一定時，溶液吸光度隨著溶劑用量增加先增加后減小，且變化范圍較小。當料液比一定時，溶液吸光度隨著溶劑濃度的增加，呈降低趨勢，提示應選取較低的溶劑濃度。

2.3.3 響應面最優(yōu)工藝篩選與驗證

用Design expert 8.0.6 軟件中Solutions 分析，得到超聲輔助乙醇提取橡子殼斗的最優(yōu)工藝為：提取溫度60.09 ℃、溶劑濃度 40%、料液比 1 ∶35.5（g/mL），在最優(yōu)條件下吸光度預測值為0.587。驗證試驗：提取溫度60.0 ℃、溶劑濃度 40%、料液 1 ∶35.5（g/mL）、提取時間40 min 條件下進行試驗得到提取液吸光度為0.586，與預測值相吻合。驗證后確定超聲輔助乙醇提取橡子殼斗最優(yōu)工藝為：提取溫度60.0 ℃、溶劑濃度40%、料液比 1 ∶35.5（g/mL）、提取時間 40 min。將最優(yōu)工藝獲得提取液于50 ℃常壓干燥、研磨后獲得粉狀固體并稱重，計算最優(yōu)工藝下的提取率為26.3%，計算公式如下：提取率/%=[粉狀固體質量（g）/橡子殼斗質量（g）]×100

2.4 提取物表征

2.4.1 pH 值對橡子殼斗提取液穩(wěn)定性影響

不同pH 值調節(jié)下橡子殼斗提取液均未產生沉淀或渾濁，也未出現(xiàn)嚴重褪色。僅表現(xiàn)為顏色變化及檢測波長下吸光度變化，具體影響見圖9。

圖9 pH 值對橡子殼斗提取物溶液吸光度的影響Fig.9 Effect of pH on absorbance of acorn shell extract solution

由圖9 可知，在酸性條件下，吸光度減小，溶液顏色變淺呈黃色；在堿性條件下，溶液吸光度增長較明顯，且溶液顏色加深至棕紅色。表明酸、堿性環(huán)境對其組分均有影響，但在較寬范圍內均表現(xiàn)穩(wěn)定，不產生沉淀或變?yōu)闊o色。該提取物溶液隨pH 越高吸光度越大且有顏色又黃變化為棕紅，提示其用做色素具有潛在的應用價值。

2.4.2 金屬離子對橡子殼斗提取液穩(wěn)定性影響

金屬離子的影響結果，見表4。

表4 金屬離子對于橡子殼斗提取物溶液穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of metal ions on the stability of acorn shell extract solution

由表4 可知，鈉離子、鈣離子、鉀離子對于橡子殼斗提取物溶液的影響極小，幾乎未改變其波譜性質，故對橡子殼斗提取物穩(wěn)定性無影響；鋅離子、鎂離子并未大幅改變橡子殼斗提取物檢測波長下的吸光度，但吸光度均有一定的上升或下降，都出現(xiàn)了少量黃色絮狀沉淀。說明此兩者對于橡子殼斗穩(wěn)定性有一定程度的影響；鋁離子使得吸光度有大幅度減少，故鋁離子對于橡子殼斗溶液的穩(wěn)定性有著較大影響；鐵離子和銅離子，表現(xiàn)為使溶液產生黑綠色沉淀和黑色沉淀，且伴隨著溶液顏色加深，故鐵離子和銅離子對橡子殼斗提取物溶液穩(wěn)定性有著極大的影響。

2.4.3 DPPH 自由基清除能力

橡子殼斗提取物對DPPH 自由的基清除能力結果見圖10。

由圖10 可知，DPPH 自由基的清除率隨橡子殼斗的濃度升高而增大，且清除能力略低于VC。反應后的溶液有明顯的顏色變化，且不同濃度溶液有明顯的梯度變化。在濃度達到0.05 g/L 時，清除率已達到95 %。

圖10 DPPH 自由基清除能力測定Fig.10 Free radical-scavenging activity on DPPH·

2.4.4 總還原能力的測定

橡子殼斗提取物總還原力測定結果見圖11。

由圖11 可知，橡子殼斗能使鐵氰化鉀的三價鐵還原成二價鐵（亞鐵氰化鉀），二價鐵進一步在和FeCl3反應，生成在700 nm 處有最大吸光度的普魯士藍（Fe4[Fe（CN）6]3），且吸光度越高，待測物的還原力越強。橡子殼斗的總還原力大于VC。

圖11 總還原力測定Fig.11 Determination of total reducing force

3 結論

采用超聲輔助乙醇提取法對橡子殼斗進行提取，單因素試驗得到影響橡子殼斗提取率的主要因素為：溶劑濃度、料液比、提取溫度。更進一步，運用響應面優(yōu)化法得到影響因素順序：溶劑濃度＞料液比＞提取溫度，及二次回歸模型為：

吸光度=0.56-4.875×10-3×A-0.043×B-0.019×C+3.500×10-3×AB-0.020×AC+0.012×BC-0.040×A2-0.023×B2-0.035×C2

最終確定了最優(yōu)工藝為提取溫度60.0 ℃、溶劑濃度 40%、料液比 1 ∶35.5（g/mL），在最優(yōu)條件下提取物溶液吸光度預測值為0.587，驗證試驗溶液實際吸光度為0.586，與預測值吻合。且在最優(yōu)工藝下的測得提取率為26.3%。表征了提取物的穩(wěn)定性、抗氧化性、總還原力，結果為：橡子殼斗提取物在酸性環(huán)境中檢測波長下吸光度減小，溶液呈黃色；堿性環(huán)境中，吸光度增加，顏色加深，呈棕紅色。K+，Na+，Ca2+對提取物溶液無影響；Mg2+，Zn2+對提取物溶液影響較小，形成少量絮狀沉淀；Fe3+，Cu2+，Al3+，易與提取物絡合形成沉淀，溶液吸光度減小明顯。提取物對DPPH 自由基的清除率略低于VC；鐵離子總還原力略高于VC，具有一定的抗氧化性。

綜上可見，橡子殼斗提取物得率可觀，為其進一步開發(fā)利用奠定了物質基礎。提取物表現(xiàn)為棕色，可作為棕色素應用于食品、化妝品、藥品的染色調色方面；其對常見離子表現(xiàn)穩(wěn)定，可以配置成溶液使用，調整溶液pH 值可調節(jié)顏色呈黃色至棕紅色變化，有交寬pH 值使用范圍。該提取物具有一定的抗氧化、抗自由基作用，應用于食品提供染色的同時可起一定抗氧化作用，延緩食品的氧化變質，具有一定的開發(fā)利用價值。