韓耀倫 王 璐 馬 欣

(河南省人民醫(yī)院口腔科，鄭州450000)

牙周病是口腔常見的炎癥性疾病，臨床治療的難點為牙周組織的不可逆性喪失，其治療的核心為牙周缺損骨質(zhì)的修復，干細胞在骨質(zhì)缺損修復中具有重要作用，尤其牙周膜干細胞[1]。骨質(zhì)缺損修復受多種炎性因子影響，也受錯綜復雜的信號通路的調(diào)控[2]。研究表明腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)可抑制牙周膜干細胞的成骨分化[3]；研究證實Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)是重要的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在成骨分化中發(fā)揮重要作用[4]；細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(Extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)在細胞增殖和分化中具有重要作用，是細胞增殖分化的網(wǎng)絡核心，Runx2為其下游靶基因重要成員，轉(zhuǎn)錄水平受ERK1/2信號通路調(diào)控[5]。 ERK1/2-Runx2通路是否在TNF-α抑制牙周膜干細胞成骨分化中發(fā)揮作用尚不清楚。本文將對其進行研究，為臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1牙周膜標本來源 牙周膜標本來自我院口腔科門診18例正畸治療患者拔出的40顆第一或第二前磨牙，患者近期無急性感染、無牙體及根尖周疾病、無全身系統(tǒng)性疾病、無慢性感染性疾病、無吸煙和特殊藥物服用史，標本取樣前經(jīng)患者知情同意。

1.1.2主要試劑 胎牛血清、PBS、α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶(美國HyClone公司)，表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)、茜素紅粉劑、TNF-α等(美國Worthington公司)，鼠抗人APC標記的CD31和CD45單抗、FITC標記的CD90單抗、PE標記的CD105單抗(美國eBioscience公司)，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈免疫反應(Reverse transcription-polymerase chain immuno-reaction，RT-PCR)試劑盒(美國Sigma公司)，鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(Zinc finger structure transcription factor，Osterix)、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2、β-actin等抗體(美國Invitrogen公司)。

1.2方法

1.2.1牙周膜干細胞分離和培養(yǎng) 將患者[年齡(24.16±4.21)歲，男性6例，女性12例]正畸拔除的前磨牙拔除后，放入α-MEM細胞培養(yǎng)液(含3倍雙抗)中，由冠向根部刮取根中1/3牙周膜，將刮取的組織塊剪成約1 mm3，1 000 r/min離心5 min，Ⅰ 型膠原酶消化，加入培養(yǎng)液終止消化，離心后棄上清液，加入適量培養(yǎng)液，接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞從組織塊中爬出并達80%～90%融合時進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2牙周膜干細胞鑒定 取傳代培養(yǎng)第4代細胞，胰蛋白酶消化后離心，用PBS液重懸，將細胞密度調(diào)整為2×106個/ml，分別加入鼠抗人APC標記的CD31和CD45、FITC標記的CD90、PE標記的CD105單抗，空白對照不加，孵育20 min后采用流式細胞儀檢測細胞表面標記物。

1.2.3實驗分組及處理 將生長良好的第3代牙周膜干細胞分為對照組、TNF-α組和激動劑組，對照組加入成骨誘導液(含0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml維生素C)[6]培養(yǎng)；TNF-α組在成骨誘導液中加入TNF-α(10 ng/ml)[6]培養(yǎng)；激動劑組在成骨誘導液中加入TNF-α(10 ng/ml)和ERK通路激動劑EGF(30 ng/ml)[7]培養(yǎng)。將細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制備成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2×104個/ml，接種到6孔板中，每組設7個復孔，培養(yǎng)至細胞達70%融合后更換為各組含相應成分的成骨誘導液，每3天換液1次。

1.2.4ALP染色及活性測定 ①ALP染色：將上述3組細胞接種到6孔板中加入相應成分的成骨誘導液成骨誘導1周后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，多聚甲醛固定1 h，PBS洗滌，加入BCIP/NBT工作液孵育30 min，PBS洗滌，顯微鏡下拍照觀察染色情況。②ALP活性測定：將生長良好的第3代牙周膜干細胞制備成細胞懸液，每孔1 000個細胞接種到96孔板中，MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后換成成骨誘導液，3 d換液，7 d棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入0.2% Triton X-100孵育30 min，顯微鏡下觀察細胞情況，每孔加入ALP基質(zhì)液和含有p-硝基苯磷酸的碳酸鹽緩沖液孵育30 min，加入顯色液，酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長520 nm處吸光值，每組7個孔，取平均值。

1.2.5茜素紅染色定量 將上述3組細胞接種到6孔板中加入相應成分的成骨誘導液成骨誘導3周后，吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌，多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，加入茜素紅染色液孵育30 min，PBS洗滌，顯微鏡下拍照觀察染色情況。拍照后每孔加入氯化十六烷吡啶孵育15 min，移入96孔板，酶聯(lián)免疫檢測波長540 nm處吸光度值。鈣化結(jié)節(jié)值=目標組吸光度值/對照組吸光度值。

1.2.6牙周膜干細胞Osterix、OPN、ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2蛋白水平測定 采用Western blot測定牙周膜干細胞Osterix、OPN、ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2蛋白水平。將上述3組細胞接種到6孔板中加入相應成分的成骨誘導液成骨誘導1周后，提取各組細胞總蛋白，測定各組總蛋白濃度，加入上樣緩沖液上樣，制備SDS-PAGE膠，進行電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉、洗膜，加入一抗過夜孵育，加入二抗孵育2 h，加入ECL發(fā)光劑，BioRad圖像分析系統(tǒng)分析牙周膜干細胞Osterix、OPN、ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2蛋白水平，目標蛋白水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1牙周膜干細胞分離培養(yǎng) 原代培養(yǎng)第3天，可見細胞從牙周膜組織塊邊緣爬出(黑色為組織塊，淺色區(qū)域為爬出細胞)，培養(yǎng)第8天時，牙周膜組織周圍細胞達80%～90%融合時進行傳代，細胞傳代至第3代時，細胞生長良好、形態(tài)單一、輪廓清晰，呈長梭形。見圖1。

2.2牙周膜干細胞鑒定 流式細胞儀鑒定結(jié)果顯示：CD90陽性率為94.23%，CD105陽性率為91.15%，CD31陽性率為0.46%，CD45陽性率為0.53%。表明培養(yǎng)細胞為牙周膜干細胞[8]。見圖2。

2.33組牙周膜干細胞ALP和茜素紅染色情況 ①ALP染色情況：與對照組比較，TNF-α組染色程度低，激動劑組染色程度介于兩者之間。②茜素紅染色情況：3組細胞中均見紅褐色礦化結(jié)節(jié)，與對照組比較，TNF-α組染色淺、數(shù)量少、面積小，激動劑組染色介于對照組和TNF-α組之間，見圖3、4。3組細胞ALP活性和礦化結(jié)節(jié)定量比較：與對照組比較，TNF-α組和激動劑組ALP活性和礦化結(jié)節(jié)降低(P<0.05)，與TNF-α組比較，激動劑組ALP活性和礦化結(jié)節(jié)升高(P<0.05)。見表1。

圖1 牙周膜干細胞原代和第3代細胞形態(tài)(×100)Fig.1 Primary and third-generation cell morphology of periodontal ligament stem cells (×100)Note: A.The third day of primary culture；B.The third generation of passage.

圖2 流式細胞儀鑒定牙周膜干細胞表面標記物Fig.2 Flow cytometry identifies surface markers of periodontal ligament stem cells

2.43組牙周膜干細胞Osterix和OPN蛋白水平比較 與對照組比較，TNF-α組和激動劑組Osterix和OPN蛋白水平降低(P<0.05)，與TNF-α組比較，激動劑組Osterix和OPN蛋白水平升高(P<0.05)。見表2和圖5、6。

2.53組牙周膜干細胞ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2蛋白水平比較 3組牙周膜干細胞ERK1/2蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與對照組比較，TNF-α組和激動劑組p-ERK1/2、Runx2蛋白水平降低(P<0.05)，與TNF-α組比較，激動劑組p-ERK1/2、Runx2蛋白水平升高(P<0.05)。見表3和圖7、8。

圖3 3組牙周膜干細胞ALP染色Fig.3 Three groups of periodontal ligament stem cells ALP stainingNote: A.Control group；B.TNF-α group；C.Agonist group.

圖4 3組牙周膜干細胞茜素紅染色Fig.4 Three groups of periodontal ligament stem cells Alizarin red stainingNote: A.Control group；B.TNF-α group；C.Agonist group.

表1 3組牙周膜干細胞ALP活性和礦化結(jié)節(jié)比較(n=7)

Tab.1 Comparison of ALP activity and mineralized nodules in three groups of periodontal ligament stem cells (n=7)

GroupsALP activityMineralized nodules(%)Control group0.44±0.07100.02±6.57TNF-α group0.15±0.041)56.32±4.751)Agonist group0.36±0.051)2)87.46±5.381)2)F52.344112.283P<0.001<0.001

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the TNF-α group,2)P<0.05.

表2 3組牙周膜干細胞Osterix和OPN蛋白水平比較(n=7)

Tab.2 Comparison of Osterix and OPN protein levels in three groups of periodontal ligament stem cells(n=7)

GroupsOsterix proteinOPN proteinControl group0.69±0.090.74±0.10TNF-α group0.18±0.051)0.22±0.071)Agonist group0.37±0.081)2)0.39±0.091)2)F82.06564.187P<0.001<0.001

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the TNF-α group,2)P<0.05.

圖5 3組牙周膜干細胞Osterix和OPN蛋白水平Western blot電泳圖Fig.5 Western blot analysis of Osterix and OPN protein levels in three groups of periodontal ligament stem cellsNote: A.Control group；B.TNF-α group；C.Agonist group.

圖6 3組牙周膜干細胞Osterix和OPN蛋白水平比較Fig.6 Comparison of Osterix and OPN protein levels in three groups of periodontal ligament stem cells

表3 3組牙周膜干細胞ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2蛋白水平比較(n=7)

Tab.3 Comparison of ERK1/2,p-ERK1/2,Runx2 protein levels in three groups of periodontal ligament stem cells (n=7)

GroupsERK1/2 proteinp-ERK1/2 proteinRunx2 proteinControl group0.28±0.070.76±0.110.92±0.13TNF-α group0.27±0.080.28±0.071)0.31±0.101)Agonist group0.25±0.060.46±0.091)2)0.48±0.121)2)F0.32949.19550.390P0.724<0.001<0.001

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the TNF-α group,2)P<0.05.

圖7 3組牙周膜干細胞ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2蛋白水平Western blot電泳圖Fig.7 Western blot analysis of ERK1/2,p-ERK1/2 and Runx2 protein levels in three groups of periodontal ligament stem cellsNote: A.Control group；B.TNF-α group；C.Agonist group.

圖8 3組牙周膜干細胞Osterix和OPN蛋白水平比較Fig.8 Comparison of Osterix and OPN protein levels in three groups of periodontal ligament stem cells

3 討論

TNF-α作為炎癥細胞因子和干細胞的成骨分化關(guān)系密切[9,10]，如在骨質(zhì)疏松條件下，TNF-α可抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[11]；不同濃度的TNF-α對根尖乳頭干細胞的增殖具有促進作用，對根尖乳頭干細胞的礦化和成牙成骨向分化具有抑制作用[12]。牙周炎時牙周膜干細胞會暴露在炎性環(huán)境中，炎性環(huán)境直接影響牙周膜干細胞的功能，牙周炎時的炎性環(huán)境包含多種炎性細胞因子，以TNF-α為主。TNF-α等炎性細胞因子刺激可引起牙周膜干細胞生物學特性的改變，降低牙周膜干細胞的成骨能力，從而影響骨組織的再生。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α與牙周膜干細胞共同培養(yǎng)，可減弱牙周膜干細胞的ALP和茜素紅染色程度，降低ALP活性和礦化結(jié)節(jié)，降低牙周膜干細胞Osterix和Runx2蛋白水平。ALP為早期成骨標志，可促進細胞成熟和鈣化，ALP水平可反映成骨細胞分化水平，ALP活性越高表明成骨細胞分化越明顯[13,14]。鈣化結(jié)節(jié)是成骨細胞分化成熟的標志，也是成骨細胞行使成骨功能的形態(tài)學表現(xiàn)，觀察鈣化結(jié)節(jié)是研究成骨細胞分化的主要手段之一[15,16]。Osterix為調(diào)節(jié)成骨細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，Osterix水平可作為成骨細胞分化程度的標志，其水平降低表明成骨分化能力下降[17,18]。OPN在多種組織中合成和分泌，是成骨細胞成熟分化的標志[19,20]。因此本研究表明TNF-α可抑制牙周膜干細胞的成骨分化。

ERK1/2的激活和多種細胞行為關(guān)系密切，在細胞增殖和分化中發(fā)揮信號網(wǎng)絡核心的作用，ERK1/2被上游的激酶激活后可激活其下游轉(zhuǎn)錄因子，從而對細胞的增殖和分化的靶基因進行調(diào)控，最終調(diào)控細胞的增殖和分化等[21]。研究發(fā)現(xiàn)Runx2為ERK1/2通路下游重要的靶基因之一，其轉(zhuǎn)錄水平受ERK1/2信號通路的調(diào)控，ERK1/2活化后可激活Runx2蛋白，使Runx2蛋白在脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸部位發(fā)生磷酸化，從而使Runx2具有轉(zhuǎn)錄活性，具有轉(zhuǎn)錄活性的Runx2通過調(diào)控下游靶基因的表達發(fā)揮促進成骨細胞分化的作用[22]。骨基質(zhì)分泌和礦化的主要細胞為成骨細胞，Runx2是公認的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，Runx2可與多種成骨基因啟動子上順式作用元件特異性結(jié)合，促進成骨靶基因轉(zhuǎn)錄表達；Runx2是聯(lián)系胞內(nèi)成骨細胞功能分化和胞外成骨誘導因素的信號通路樞紐[23,24]。本研究發(fā)現(xiàn)：TNF-α與牙周膜共同培養(yǎng)可降低牙周膜干細胞p-ERK1/2、Runx2蛋白水平；給予ERK通路激動劑處理后，可改善TNF-α對牙周膜干細胞p-ERK1/2、Runx2蛋白水平的抑制作用，并可改善TNF-α對牙周膜干細胞成骨分化的抑制作用。因此分析TNF-α可能通過抑制ERK1/2-Runx2信號通路的激活，從而抑制成骨靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，發(fā)揮抑制牙周膜干細胞成骨分化的作用。

綜上所述，TNF-α對牙周膜干細胞成骨分化的抑制作用可能與ERK1/2-Runx2信號通路有關(guān)，激活ERK1/2-Runx2信號通路可改善TNF-α對牙周膜干細胞成骨分化的抑制作用。本研究為牙周病的治療提供了新的治療靶點。