劉宇宏 曹慧琴 劉 卉 李曉勇

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院免疫科，延安716000)

急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種起源于淋巴細(xì)胞的B系或T系細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生的惡性腫瘤性疾病[1]。根據(jù)我國白血病發(fā)病情況調(diào)查，ALL發(fā)病率約為0.67/10萬[2]。在油田、污染區(qū)發(fā)病率明顯高于全國發(fā)病率。ALL兒童期(0～9歲)為發(fā)病高峰，可占兒童白血病的70%以上[3]。已有研究表明神經(jīng)菌毛素-1(Neuropilin-1,NRP-1)在白血病細(xì)胞中有表達，且ALL中NRP-1的表達較急性髓性白血病(Acute myloid leukemia,AML)中表達更多見[4-6]。

NRP-1最早是作為神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向調(diào)節(jié)因子受體被發(fā)現(xiàn)，是一類在脊椎動物中高度保守的分子量為130～140 kD的糖蛋白[7,8]。而近年來大量研究結(jié)果顯示，人類的許多腫瘤組織上都有NRP-1的表達，包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌，而在相應(yīng)的正常組織中幾乎不表達[9,10]。NRP-1作為血管生長因子的共受體，在腫瘤血管新生方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[11]。目前，NRP-1對急性淋巴系白血病細(xì)胞生物學(xué)特性影響的相關(guān)研究較少。本研究旨在初步探討NRP-1在急性淋巴細(xì)胞白血病CCRF-CEM細(xì)胞系中的表達及其對CCRF-CEM增殖遷移等生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 RPMI1640培養(yǎng)液、DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清FBS(Gibco)；LB培養(yǎng)基(Solarbio)、Lipofec-tamine 2000(Thermo Fisher Scientific)；全自動細(xì)胞計數(shù)儀(Countstar-全自動細(xì)胞計數(shù)儀)；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室(Corning)；高速離心機(Thermo Fisher Scientific)；生物顯微鏡(EVOS)；NRP-1抗體(GeneTex)。CCRF-CEM細(xì)胞和293T細(xì)胞購買于上海豐暉生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) CCRF-CEM細(xì)胞使用含10%FBS和1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液，293T細(xì)胞使用含10%FBS和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液。兩種細(xì)胞均置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2NRP-1敲低細(xì)胞系構(gòu)建及NRP-1抗體結(jié)合能力的鑒定 本研究采用四個質(zhì)粒系統(tǒng)在293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒，其中pLv-NRP-1/shRNA重組質(zhì)粒由上海吉滿生物公司構(gòu)建。采用脂質(zhì)體2000逆轉(zhuǎn)染法在6孔板的293T細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染四個質(zhì)粒(pLv-NRP-1/shRNA∶pMDLg/pRRE∶pVSV-G∶pRSV-Rev =2.0 μg∶1.0 μg∶0.6 μg∶0.4 μg，共4 μg總DNA)，脂質(zhì)體2000使用量為10 μl。8～12 h后，移去舊培養(yǎng)液，更換為2 ml新鮮的DMEM完全培養(yǎng)液，放回37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后收上清病毒，感染和篩選目的細(xì)胞，得到穩(wěn)定株。使用Western blot 檢測敲低細(xì)胞株NRP-1蛋白表達水平。

共聚焦顯微鏡檢測NRP-1抗體與細(xì)胞的結(jié)合能力。在6孔板中培養(yǎng)野生型細(xì)胞和NRP-1敲低細(xì)胞，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，加入熒光素BRITC標(biāo)記的NRP-1抗體與細(xì)胞共同孵育30 min。收集細(xì)胞，PBS輕輕洗滌3次，除去游離和非特異性結(jié)合的抗體后做細(xì)胞滴片，滴片固定后共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3細(xì)胞計數(shù)儀檢測抑制NRP-1功能對細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)增長期的CCRF-CEM野生型細(xì)胞和NRP-1-shRNA-CCRF-CEM細(xì)胞分別稀釋成2×105ml-1。將上述兩種細(xì)胞分為3組：野生型CCRF-CEM細(xì)胞組+PBS組，野生型CCRF-NRP-1-shRNA-CCRF-CEM細(xì)胞組+PBS組和野生型CCRF-CEM細(xì)胞+NRP-1抗體組(分別記作PBS組，NRP-1-shRNA組和NRP-1 antibody組)。將上述3組細(xì)胞接種到12孔板，每組設(shè)4個時間點，每個時間點設(shè)3個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)后6 h、12 h、24 h和48 h使用細(xì)胞計數(shù)儀測細(xì)胞數(shù)量，每次測量前均使用槍頭吹打混勻。以PBS組為陰性對照，按照公式：抑制率=1-(陰性對照組細(xì)胞數(shù)-實驗組細(xì)胞數(shù))/陰性對照組細(xì)胞數(shù)，計算兩種方法抑制NRP-1對細(xì)胞的增殖抑制率。

1.2.4Transwell檢測抑制NRP-1功能對細(xì)胞遷移能力的影響 取對數(shù)增長期的CCRF-CEM野生型細(xì)胞和NRP-1-shRNA-CCRF-CEM細(xì)胞稀釋成2×105ml-1并分為3組，分組同1.2.3(PBS組，NRP-1-shRNA組和NRP-1antibody組)，分別取100 μl加入Transwell上腔，下腔放入600 μl含有0.5%BSA的RPMI1640 培養(yǎng)液。于37℃,5%CO2條件下孵箱培養(yǎng)6 h和12 h后,收集下腔的細(xì)胞做細(xì)胞計數(shù)。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測抑制NRP-1功能對細(xì)胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的野生型CCRF-CEM細(xì)胞和NRP-1-shRNA-CCRF-CEM細(xì)胞稀釋成10×104ml-1，轉(zhuǎn)移至6孔板中培養(yǎng)。分為3組(同1.2.3)并做相應(yīng)處理。于37℃,5%CO2條件培養(yǎng)24 h和48 h后，收集細(xì)胞并用500 μl Binding buffer重懸細(xì)胞后，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色液，混勻后室溫孵育15 min。孵育完畢收集細(xì)胞用預(yù)冷500 μl PBS重懸后流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6細(xì)胞計數(shù)儀檢測抑制NRP-1功能對細(xì)胞耐藥的影響 取對數(shù)生長期的CCRF-CEM野生型細(xì)胞和NRP-1-shRNA-CCRF-CEM細(xì)胞按1.2.3分為3組后，用含有不同濃度的表阿霉素(EPI)的培養(yǎng)基稀釋成2×105ml-1，每組細(xì)胞的EPI終濃度分別為0.001、0.01、0.1、0.2、0.5、1 μg/ml。于37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，使用細(xì)胞計數(shù)儀計算凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)。分別計算各組細(xì)胞在不同濃度EPI處理下的細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1NRP-1敲低細(xì)胞株及NRP-1抗體結(jié)合能力的鑒定 Western blot結(jié)果(圖1)顯示，野生型細(xì)胞組在130 kD附近出現(xiàn)一明顯特異性條帶，與NRP-1理論分子量復(fù)合。而NRP-1-shRNA組的NRP-1蛋白表達量較野生型細(xì)胞明顯降低。結(jié)果表明，成功構(gòu)建NRP-1敲低的CCRF-CEM細(xì)胞株，且敲低效率較明顯。

圖2為共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果，在野生型細(xì)胞中，可見明顯紅色熒光在細(xì)胞表面集聚，而NRP-1敲低組則沒有。結(jié)果表明，NRP-1抗體可在活體細(xì)胞中與NRP-1結(jié)合。

2.2細(xì)胞計數(shù)儀檢測抑制NRP-1功能對細(xì)胞增殖的影響 以PBS組為陰性對照，根據(jù)公式計算出處理組的增殖抑制率并繪制統(tǒng)計圖，結(jié)果如圖3所示，NRP-1-shRNA組和NRP-1 antibody組的細(xì)胞在兩個時間點的增殖均受到不同程度的抑制。且48 h的抑制率較12 h明顯。結(jié)果提示，抑制NRP-1功能能顯著抑制細(xì)胞的增殖。

2.3Transwell檢測抑制NRP-1功能對細(xì)胞遷移能力的影響 用Transwell檢測上訴兩個處理組遷移能力的改變。結(jié)果如圖4所示，NRP-1-shRNA組和NRP-1 antibody組的細(xì)胞遷移能力較PBS組都有不同程度的降低，下室細(xì)胞量與相應(yīng)時間段的PBS陰性對照組有顯著差異。

圖1 Western blot檢測NRP-1敲低細(xì)胞株NRP-1蛋白表達量Fig.1 NRP-1 protein expression of NRP-1 knockdown cell line by Western blot

圖2 共聚焦顯微鏡分析NRP-1抗體與野生型細(xì)胞的結(jié)合能力Fig.2 Analyze binding ability of NRP-1 antibody to wild-type cells by confocal microscope

圖3 NRP-1 抗體和NRP-1敲低后細(xì)胞增殖抑制率(n=3)Fig.3 Cell proliferation inhibition rate of different groups(n=3)Note: *.P<0.05，**.P<0.01.

2.4流式細(xì)胞儀檢測抑制NRP-1功能對細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測NRP-1-shRNA組和NRP-1antibody組的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖5所示，左下象限(Q4)為正?；罴?xì)胞，早期凋亡細(xì)胞在右下象限(Q2)，中晚期細(xì)胞則出現(xiàn)在右上象限(Q3)。NRP-1抗體組和NRP-1敲低組均能促進細(xì)胞凋亡，且凋亡多集中在Q2象限，為早期凋亡。細(xì)胞凋亡數(shù)與陰性對照PBS組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.5抑制NRP-1功能對細(xì)胞耐藥的影響 細(xì)胞對化療藥物的敏感性可以一定程度反映細(xì)胞的耐藥程度，本實驗通過計算加入化療藥物后的細(xì)胞凋亡率來評估NRP-1對細(xì)胞耐藥的影響。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)藥物濃度過低或過高時，抑制NRP-1功能對細(xì)胞凋亡率的影響均不明顯。而當(dāng)化療藥物濃度在0.1～0.5 μg/ml時，兩種方法抑制NRP-1功能均能增加細(xì)胞對化療藥物的敏感性，使細(xì)胞凋亡率增加。

圖4 NRP-1 抗體和NRP-1敲低對細(xì)胞遷移的影響(n=3)Fig.4 Effects of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on cell migration(n=3)Note: *.P<0.05，**.P<0.01.

圖5 NRP-1 抗體和NRP-1敲低對細(xì)胞凋亡的影響(n=3)Fig.5 Effects of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on cell apoptosis(n=3)

圖6 NRP-1 抗體和NRP-1敲低對化療藥物耐藥的影響(n=3)Fig.6 Effects of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on chemotherapy drug resistance(n=3)Note: *.P<0.05，**.P<0.01.

3 討論

兒童ALL治療效果在近50年來穩(wěn)步提高，5年無事件生存率達80%。但是難治復(fù)發(fā)仍是ALL治療的難點，難治復(fù)發(fā)性ALL的預(yù)后差，生存期短[12，13]。兒童難治復(fù)發(fā)ALL的5年生存率在20%以下[14]。故尋找關(guān)鍵性的新作用靶點尤為重要。NRP-1在許多腫瘤上均有高表達，但是對白血病尤其是急性淋巴細(xì)胞白血病的相關(guān)研究較少。相關(guān)研究報道[4-6]，NRP-1在急性髓性白血病患者白血病細(xì)胞中有表達，但是NRP-1在血液系統(tǒng)及白血病細(xì)胞生物學(xué)特性的影響尚不清楚。本研究以急性淋巴細(xì)胞白血病CCRF-CEM細(xì)胞為研究對象，采用敲低NRP-1或NRP-1抗體兩種方法抑制細(xì)胞NRP-1的功能，且與野生型細(xì)胞比較，從而探討NRP-1對急性淋巴細(xì)胞的生物學(xué)特征的影響。

白血病細(xì)胞的生物學(xué)特點主要有細(xì)胞增殖異常，正常的凋亡程序失控使細(xì)胞凋亡率降低。通過抑制白血病細(xì)胞的增殖或促進其凋亡是白血病治療的重要思路。本實驗中，使用兩種方法抑制NRP-1功能后，細(xì)胞的增殖能力均顯著降低，而凋亡率則顯著增加。說明NRP-1對CCRF-CEM的發(fā)生發(fā)展可能有促進作用。在抑制NRP-1功能后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，細(xì)胞發(fā)生凋亡，且多集中在早期凋亡。

白血病細(xì)胞的原發(fā)或繼發(fā)耐藥是導(dǎo)致ALL療效差及復(fù)發(fā)率與死亡率高的重要原因[15]。近年來，探究ALL的耐藥機制、如何克服或逆轉(zhuǎn)耐藥成為ALL的研究熱點。王紅梅等[16]的研究表明，沉默NRP-1基因后，人T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株對化療藥物敏感性增加。在本研究中，在CCRF-CEM細(xì)胞中也得到相同結(jié)果。兩種方法抑制NRP-1功能后，細(xì)胞對化療藥物的敏感性明顯增加，NRP-1或可稱為ALL的一個新的治療靶點。

本研究在細(xì)胞水平上，初步探究了NRP-1對ALL的CCRF-CEM細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響，為后期繼續(xù)深入探討NRP-1對其他ALL細(xì)胞株生物學(xué)特征的影響提供了參考，為繼續(xù)研究NRP-1對ALL患者臨床特征的影響提供了理論依據(jù)。