鄒云蓮 胡 邊 張李琛 張進(jìn)萍 朱學(xué)鍇 黃行許 嚴(yán)新民

(昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明650500)

細(xì)胞因子是調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)的重要因子。以細(xì)胞因子為基礎(chǔ)的腫瘤治療一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。IL-12，由于其在誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫方面發(fā)揮的重要作用，成為科研工作者臨床轉(zhuǎn)化研究的重點(diǎn)研究對(duì)象[1,2]。

IL-12是由樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及人類B淋巴母細(xì)胞等細(xì)胞受相應(yīng)抗原刺激后產(chǎn)生，是刺激T細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)CD8細(xì)胞記憶性，誘導(dǎo)CD4輔助細(xì)胞向Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要介質(zhì)，這是其發(fā)揮抗腫瘤機(jī)制的重要基礎(chǔ)。此外，IL-12可通過(guò)誘導(dǎo)γ干擾素和腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生，降低IL-4對(duì)IFN-γ的抑制，負(fù)性調(diào)節(jié)IL-10,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，從而促進(jìn)免疫細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)，改善免疫抑制微環(huán)境[3,4]。然而，大量臨床所研究顯示大劑量IL-12蛋白的直接輸注給機(jī)體帶來(lái)的毒副作用嚴(yán)重限制其在臨床的應(yīng)用。因此，如何安全有效地向機(jī)體導(dǎo)入IL-12使其揚(yáng)長(zhǎng)避短發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)是使IL-12走向臨床所面臨的迫切問(wèn)題[5,6]。本研究利用基因工程手段體外構(gòu)建人IL-12載體，通過(guò)非病毒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將其導(dǎo)入T細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)，初步探討該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)用的PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)由上海科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院朱學(xué)鍇博士提供；人IL-12 cDNA免費(fèi)索取于廈門大學(xué)韓家淮實(shí)驗(yàn)室；高保真PCR擴(kuò)增酶及T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；內(nèi)切酶SpeⅠ和SalⅠ購(gòu)自NBE公司；膠回收試劑盒及無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)公司；分離PBMC所用的全血來(lái)自云南省第一人民醫(yī)院；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；IL-12 ELISA試劑盒,流式檢測(cè)用抗體CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC及同型對(duì)照購(gòu)自Ebioscience公司；電轉(zhuǎn)試劑Amaxa Human T cells Nucleofector Kit 試劑盒購(gòu)自lonza公司；細(xì)胞因子IL-2，單抗CD3、CD28均購(gòu)自北京同立海源生物有限公司；過(guò)表達(dá)luciferin的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251-Luc由上?？萍即髮W(xué)黃行許教授惠贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1IL-12過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 人IL-12是由重鏈p40和輕鏈p35構(gòu)成的雙鏈結(jié)構(gòu)，兩條鏈通過(guò)二硫鍵共價(jià)連接形成功能蛋白發(fā)揮生理作用。為了構(gòu)建具有生理功能性IL-12，我們按照?qǐng)D1的設(shè)計(jì)思路進(jìn)行載體構(gòu)建。首先，從廈門大學(xué)韓家淮實(shí)驗(yàn)室免費(fèi)索取人IL-12基因克隆,利用高保真擴(kuò)增酶通過(guò)表1引物擴(kuò)增出p35和p40基因片段。在引物的設(shè)計(jì)過(guò)程中，考慮到載體多克隆位點(diǎn)，在引物兩端引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。同時(shí)，為了構(gòu)建具有功能的IL-12融合蛋白，我們選用目前最為常用的Huston設(shè)計(jì)的(GlySer)3作為p40與p35基因間的Linker。因此在引物設(shè)計(jì)時(shí)，我們?cè)趐40下游引物3′端加入Linker部分N端序列，在p35上游引物的5′端引入Linker的C端序列，并保證兩條引物的Linker有15個(gè)堿基的重疊，使后續(xù)PCR擴(kuò)增中形成p40與p35連接的穩(wěn)定接頭。

圖1 IL-12過(guò)表達(dá)載體的設(shè)計(jì)Fig.1 Vector design carrying human IL-12 gene

1.2.2IL-12與PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)連接的克隆形成 我們將IL-12基因片段與PiggyBac表達(dá)載體同時(shí)用SpeⅠ和SalⅠ酶37℃水浴中雙酶切，回收載體片段和IL-12酶切片段，T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜后取2 μl連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂Amp+抗性LB平板，37℃恒溫箱中過(guò)夜生長(zhǎng)。

1.2.3IL-12陽(yáng)性克隆的鑒定 次日挑取生長(zhǎng)的克隆于20 μl滅菌ddH2O充分振蕩混勻，取1 μl菌液用表1的IL-12B-FWD1和IL-12A-REV引物進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。隨意挑取2個(gè)陽(yáng)性擴(kuò)增的克隆搖菌過(guò)夜，小提質(zhì)粒后測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.2.4人外周血PBMC的分離 人的原代T細(xì)胞從新鮮全血中分離得到。全血來(lái)自云南省第一人民醫(yī)院的健康獻(xiàn)血者。使用淋巴細(xì)胞分離液從新鮮的全血或白膜中分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。新鮮分離的PBMC用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco)按1×107ml-1細(xì)胞密度重懸接種于6孔板后于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼板2 h。取出6孔板，輕吹細(xì)胞，收取未貼壁細(xì)胞(未貼壁的細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，包含B和T細(xì)胞；貼壁的細(xì)胞有單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等)于離心管中以800 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，用于后續(xù)電轉(zhuǎn)。

1.2.5PBMC的電轉(zhuǎn)及T細(xì)胞的體外擴(kuò)增 配制電轉(zhuǎn)體系，分別為:①對(duì)照組：PiggyBac空載體和轉(zhuǎn)座子酶載體(兩者的量分別為10 μg 和5 μg)；②IL-12過(guò)表達(dá)組： PB-IL-12過(guò)表達(dá)載體和轉(zhuǎn)座子酶載體(兩者的量分別為10 μg和5 μg)，兩個(gè)電轉(zhuǎn)體系中都加入0.5 μg pEGFP-N2質(zhì)粒作為電轉(zhuǎn)效率初步判斷指標(biāo)。具體步驟為：按maxa Human T cells Nucl-eofector Kit 試劑盒要求配制電轉(zhuǎn)液并與(1.5～2)×107淋巴細(xì)胞充分混勻，在混合液中加入對(duì)應(yīng)質(zhì)粒，充分混合后輕柔加入電極杯，避免氣泡產(chǎn)生，使用Lonza Nucleo-fector 2B電轉(zhuǎn)儀U-014程序電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)12 h后流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。收集細(xì)胞，離心并計(jì)數(shù)，以1×106ml-1細(xì)胞密度培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入100 U/ml 的IL-2，CD3和CD28單抗各200 ng/ml刺激細(xì)胞生長(zhǎng)3 d改用300 U/ml的IL-2維持培養(yǎng)至14 d。

表1 IL-12載體構(gòu)建中的引物序列

Tab.1 Primers used for construction of IL-12OE plasmid

PrimerSequence(5′-3′)Target siteIL-12B-FWD1CGGACTAGTATGTGTCACCAGCAGTTGGTCAT p40 Forward IL-12B-REVCGCCACCGCCGCTTCCTCCGCCTCCGCTTCCGCCTCCGCCCCTGCAGGGCACAGATGCCp40 ReverseIL-12A-FWD1GAAGCGGCGGTGGCGGCAGCAGAAACCTCCCCGTGGCCp35 ForwardIL-12A-REVGCGGTCGACTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCATCp35 ReverseIL12-SEQ1GCTCTCCACGCTTTGCCTGACIL-12seq primerIL12-SEQ2GATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATIL-12seq primerIL12-SEQ3CAAAGGCATTAAAGCAGCGTATCCIL-12seq primer

1.2.6IL-12在T細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè) 收集體外培養(yǎng)14 d的T細(xì)胞上清，用ELISA檢測(cè)上清中IL-12的表達(dá)水平。此外，為了探討IL-12過(guò)表達(dá)的T細(xì)胞在遇到腫瘤細(xì)胞時(shí)是否有更高水平的表達(dá)，我們以1×105個(gè)/孔U251-luc鋪96孔板，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，次日每孔加入2×105IL-12過(guò)表達(dá)及對(duì)照T細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱共孵育24 h后取上清行ELISA檢測(cè)IL-12水平。

1.2.7T細(xì)胞表型分析 流式檢測(cè)IL-12過(guò)表達(dá)及對(duì)照組T細(xì)胞的表型。具體方法為：在流式管中加入5×105個(gè)T細(xì)胞，用含1%FBS的PBS進(jìn)行清洗一遍，100 μl PBS重懸細(xì)胞，分別加入3 μl抗體4℃孵育15 min，取出細(xì)胞，PBS清洗兩遍后加入400 μl PBS流式檢測(cè)。

1.2.8T細(xì)胞殺傷能力檢測(cè) 將2×105腫瘤細(xì)胞U251-luc鋪于96孔板，次日按1∶1、4∶1、16∶1的效靶比加入T細(xì)胞，T細(xì)胞的體積為100 μl，每個(gè)效靶比設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。4 h后，吸出所有液體及細(xì)胞，以800 r/min離心5 min后，棄所有上清。以100 μl PBS重懸細(xì)胞后移入不透明的96孔板中，再加入100 μl 1 mg/ml的D-luciferin。立即使用酶標(biāo)儀讀取Luminal 560 nm的發(fā)射光讀數(shù)。將只含有PBS和D-luciferin的孔內(nèi)讀數(shù)N0定義為零，將未加入T細(xì)胞，只含有靶細(xì)胞的孔內(nèi)讀數(shù)N定義為100，假設(shè)某孔讀數(shù)為n ，則該孔內(nèi)的細(xì)胞殺傷效率為：1-n/(N-N0)×100%。

為進(jìn)行鏡下直觀觀察，接種100 μl細(xì)胞數(shù)為1×105U251-luc于96孔板。次日，加入等體積等細(xì)胞數(shù)T細(xì)胞，放置CO2培養(yǎng)箱24 h后于倒置顯微鏡下觀察T細(xì)胞的殺傷能力及刺激情況。

2 結(jié)果

2.1IL-12載體的成功構(gòu)建 取5 μl擴(kuò)增的p35、p40以及兩者為模塊擴(kuò)增的IL-12全基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。從圖2A中可以看出，3個(gè)片段分別在對(duì)應(yīng)區(qū)域出現(xiàn)單一條帶，其中p35大小為584 bp，p40為984 bp，IL-12全基因片段大小為1 622 bp。

在對(duì)克隆陽(yáng)性篩選中，結(jié)果如圖2B顯示，在隨機(jī)挑取的16個(gè)克隆快速擴(kuò)增后有14個(gè)在對(duì)應(yīng)的區(qū)域出現(xiàn)相應(yīng)大小的特異條帶，初步判斷這些克隆為潛在的陽(yáng)性克隆。為了進(jìn)一步驗(yàn)證克隆序列的準(zhǔn)確性，我們隨機(jī)挑取2個(gè)克隆搖菌后提取質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果證實(shí)所插入的序列為正確的基因序列。

2.2構(gòu)建的IL-12可在T細(xì)胞中形成具有生物學(xué)活性的IL-12蛋白 為了探討構(gòu)建的IL-12是否具有完整的生物學(xué)活性，我們將IL-12通過(guò)電轉(zhuǎn)方式導(dǎo)入T細(xì)胞。細(xì)胞電轉(zhuǎn)12 h后流式檢測(cè)質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)效率，結(jié)果如圖3A顯示，對(duì)照組GFP表達(dá)率為46.1%，IL-12OE組為49.2%，因此本實(shí)驗(yàn)中使用的電轉(zhuǎn)程序具有較高的電轉(zhuǎn)效率。

為了檢測(cè)構(gòu)建的IL-12是否具有生物學(xué)活性及在腫瘤刺激下是否能進(jìn)一步刺激IL-12的表達(dá)，我們用ELISA方法檢測(cè)了培養(yǎng)14 d的細(xì)胞培養(yǎng)上清以及T細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251共同作用24 h后上清中IL-12的水平。結(jié)果如圖3B顯示，在體外培養(yǎng)14 d時(shí)過(guò)表達(dá)IL-12 T細(xì)胞上清中有較高水平的IL-12蛋白[(122.55±13.8)pg/ml]，而在對(duì)照中幾乎檢測(cè)不到相應(yīng)蛋白[(0.3±0.23)pg/ml]；當(dāng)T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞混合(圖3C)，非特異性腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞IL-12均有一定刺激作用,尤其對(duì)IL-12過(guò)表達(dá)T細(xì)胞能促使更高水平分泌IL-12[Control T cells刺激前后:(2.77±1.53)pg/ml vs (18.15±5.85)pg/ml；IL-12OE T cells刺激前后：(320.55±10.85)pg/ml vs (610.05±59.7)pg/ml]。

圖2 IL-12基因的擴(kuò)增及陽(yáng)性克隆PCR的初步鑒定Fig.2 Amplification of IL-12 gene and positive clone screening with PCR array

圖3 IL-12在T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及IL-12蛋白檢測(cè)Fig.3 Transduction efficiency of IL-12 in T cells and IL-12 protein detection

圖4 IL-12過(guò)表達(dá)T細(xì)胞與對(duì)照T細(xì)胞表型分析Fig.4 Phenotype analysis of IL-12OE T cells and control T cells

圖5 T細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)Fig.5 Cell killing assay of T cells

2.3T細(xì)胞表型分析 流式檢測(cè)體外擴(kuò)增14 d T細(xì)胞CD3、CD4、CD8的表達(dá)水平。結(jié)果如圖4所示，IL-12OE組與對(duì)照組CD4、CD8陽(yáng)性T細(xì)胞數(shù)量之和均在98%以上，但 IL-12過(guò)表達(dá)T細(xì)胞組中CD4陽(yáng)性細(xì)胞明顯高于對(duì)照組(20.8% vs 5.25%)。

2.4IL-12分泌可促進(jìn)T細(xì)胞的殺傷能力 T細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，雖然制備的T細(xì)胞沒有靶向特異性，但在一定程度上仍具有非特異殺傷神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的能力。其中過(guò)表達(dá)IL-12的T細(xì)胞較對(duì)照T細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺瘤效果。顯微鏡下，IL-12的分泌能顯著提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的刺激強(qiáng)度和增殖活性并形成大量T細(xì)胞克隆團(tuán)(圖5B)。

3 討論

IL-12作為多效性細(xì)胞因子,是連接天然免疫與被動(dòng)免疫的重要橋梁，是調(diào)動(dòng)機(jī)體抗腫瘤免疫，改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境的重要介質(zhì)[7]。然而，大量臨床前及臨床實(shí)驗(yàn)研究顯示IL-12大劑量直接輸注給機(jī)體帶來(lái)的毒副反應(yīng)嚴(yán)重影響其臨床療效的評(píng)估及應(yīng)用。如何安全高效向機(jī)體導(dǎo)入IL-12蛋白，充分發(fā)揮其免疫調(diào)控及抗瘤效應(yīng)是推動(dòng)IL-12臨床應(yīng)用亟待解決的問(wèn)題[4,8,9]。

T細(xì)胞是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞通過(guò)免疫逃逸得以在體內(nèi)生長(zhǎng)增殖。因此恢復(fù)T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別和殺傷能力是抗腫瘤免疫的重要思路。近年以PD1/PD-L1免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑及嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR T)為代表的免疫療法在臨床，尤其血液系統(tǒng)腫瘤中取得的巨大成功充分驗(yàn)證了該思路的正確性[10]。然而，面對(duì)實(shí)體腫瘤，目前免疫療法仍收效甚微，這與實(shí)體瘤瘤體的免疫抑制微環(huán)境密切相關(guān)。因此，改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境，充分調(diào)動(dòng)T細(xì)胞抗腫瘤免疫是免疫細(xì)胞在實(shí)體瘤治療領(lǐng)域獲得突破的重要途徑[11]。

如前所述，IL-12無(wú)疑是改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境的理想因子。因此，利用基因工程手段將IL-12引入腫瘤局部協(xié)同T細(xì)胞抗擊實(shí)體瘤其理論可行?；诖耍狙芯课覀兝没蚬こ淌侄螛?gòu)建IL-12基因，并利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，借助電轉(zhuǎn)導(dǎo)入T細(xì)胞后獲得持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。IL-12分泌可進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)殺瘤活性。

以上結(jié)果顯示，非病毒PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是外源基因?qū)隩細(xì)胞并獲得持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的有效工具。雖然目前在T細(xì)胞基因工程領(lǐng)域，病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)仍是主流，但該轉(zhuǎn)導(dǎo)方式由于存在病毒復(fù)制、基因隨機(jī)插入，宿主抗病毒免疫反應(yīng)，制備過(guò)程復(fù)雜，價(jià)格昂貴等問(wèn)題，仍需作進(jìn)一步改進(jìn)和補(bǔ)充。非病毒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)由于在以上方面顯示明顯優(yōu)勢(shì)，近年在該領(lǐng)域獲得迅速發(fā)展，我們的結(jié)果也表明該轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的有效性。此外，T細(xì)胞可作為IL-12的有效攜帶載體。這主要表現(xiàn)為：①T細(xì)胞利用自身的調(diào)控體系使IL-12維持一定水平的表達(dá)。在腫瘤刺激下IL-12分泌水平顯著提高，這有利于在腫瘤局部形成高濃度IL-12；②IL-12的分泌可進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞增殖，提高CD4陽(yáng)性細(xì)胞占比，這可能是該組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞有更好殺瘤效果的原因。在T細(xì)胞抗腫瘤免疫中，T細(xì)胞分化亞群是影響臨床療效的重要因素[12]。在此過(guò)程中CD8+細(xì)胞一直被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞亞群。然而，近年來(lái)愈來(lái)愈多的研究顯示，CD4+細(xì)胞群在其中扮演的角色越發(fā)重要[12-15]，這可能是因?yàn)镃D4+T細(xì)胞提供的生長(zhǎng)因子和其他信號(hào)是維持輸注的CTL功能和活性的重要保障[16-18]。對(duì)于攜載IL-12的T細(xì)胞亞群中CD4+T細(xì)胞顯著高于對(duì)照細(xì)胞，我們認(rèn)為可能與IL-12細(xì)胞因子本身密切相關(guān)。如前所述，IL-12具有刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力，因此攜載IL-12的T細(xì)胞可能通過(guò)其分泌至血清中的IL-12促進(jìn)培養(yǎng)體系中CD4+T細(xì)胞亞群的大量擴(kuò)增。此外，IL-12在T細(xì)胞內(nèi)部的表達(dá)亦可能影響T細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而對(duì)CD4+T的增殖產(chǎn)生影響。對(duì)該問(wèn)題的回答仍需作進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本試驗(yàn)利用非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)——PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將IL-12高效導(dǎo)入T細(xì)胞并獲得持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。初步顯示T細(xì)胞是攜載IL-12較為理想的工具。這將為后續(xù)開發(fā)靶向腫瘤抗原的CART細(xì)胞攜載IL-12治療實(shí)體瘤提供重要的技術(shù)及理論基礎(chǔ)。