薛 艷 龐曉林 何 軍 楊永濤 關(guān) 圓 張東亞
(1清華大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院麻醉疼痛學(xué),北京100083;2清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉疼痛科,北京100016)
膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)是以關(guān)節(jié)的疼痛、僵硬腫脹,甚至功能喪失為臨床表現(xiàn)的一種慢性退行性疾病,其危險(xiǎn)因素包括老年、肥胖、創(chuàng)傷、過度使用及遺傳易感性等[1~3]。我國目前骨關(guān)節(jié)炎總患病率已達(dá)到27.18%[4],其中KOA的患病率約為 18%,并且女性 KOA 患病率顯著高于男性[5]。該疾病為患者帶來了極大的痛苦和不便,嚴(yán)重降低其生活質(zhì)量[6],因此,防治KOA是社會(huì)必要的需求,具有重要的社會(huì)價(jià)值。大多數(shù)研究認(rèn)為醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療KOA療效顯著,且治療時(shí)間為4周[7],但未有研究表明是否治療時(shí)間越長,其治療效果越好。目前,國內(nèi)外文獻(xiàn)中未見通過對(duì)臭氧治療不同時(shí)間進(jìn)行分組治療KOA的研究。本實(shí)驗(yàn)通過擬用不同治療療程的醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對(duì)KOA家兔進(jìn)行干預(yù),觀察不同治療時(shí)間醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療KOA,對(duì)關(guān)節(jié)液中SOD及關(guān)節(jié)軟骨的影響,探討臭氧治療時(shí)間與KOA療效的關(guān)系。
30只健康新西蘭實(shí)驗(yàn)家兔(普通級(jí)),體重2.0~2.5 kg,購自芳元緣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào):SCXK(京)2014-0012]。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后適應(yīng)性喂養(yǎng)3天,單籠單兔喂養(yǎng),保持室溫23~25℃,相對(duì)濕度40%~60%,通風(fēng)。利用抽簽法將家兔隨機(jī)分為正常組對(duì)照組(N)、模型組對(duì)照組(M)、2周臭氧治療組(O3-2)、4周臭氧治療組(O3-4)、6周臭氧治療組(O3-6),每組6只。
臭氧生成儀(CHY-31T,山東淄博悅?cè)A醫(yī)療器械有限公司);兔子雙足平衡支撐力測(cè)量儀(YLS-11A,北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司);超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)試劑盒(北京方程生物科技有限公司)。
N組正常飼養(yǎng),不做模型手術(shù);M組、O3-2組、O3-4組及O3-6組采用經(jīng)典Hulth改良法[8]制作KOA模型:麻醉后,于兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)中內(nèi)側(cè)做長約1 cm的縱行皮膚切口,摘除內(nèi)側(cè)半月板、切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶。術(shù)中避免損傷關(guān)節(jié)軟骨面,術(shù)后連續(xù)三天抗生素抗感染治療,術(shù)后一周開始驅(qū)趕動(dòng)物活動(dòng)30 min,連續(xù)12周。3個(gè)月后O3-2組、O3-4組及O3-6組兔左膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射20 μg/ml臭氧,每次2 ml,每周1 次,分別注射2周、4周及6周。
N組與M組3個(gè)月后麻醉藥物過量處死家兔,O3-2組、O3-4組及O3-6組分別于末次治療后3天處死。處死后,抽取1ml生理鹽水注入家兔左膝關(guān)節(jié)腔,充分活動(dòng)膝關(guān)節(jié)后抽取關(guān)節(jié)灌洗液,測(cè)定SOD OD值。再解剖左膝關(guān)節(jié),首先觀察軟骨形態(tài)學(xué)變化,然后切開取股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨及軟骨下骨,標(biāo)本進(jìn)行固定、脫鈣、石蠟包埋及切片后,行HE及甲苯胺藍(lán)(Toluidine blue, TB)染色,并且行Mankin's評(píng)分[9]。
每次取材前觀察并記錄局部疼痛刺激反應(yīng)、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動(dòng)度、關(guān)節(jié)腫脹程度。用“測(cè)定雙足平衡設(shè)備”檢測(cè)臭氧治療前(即第一次注射臭氧前)與治療后(即處死前)兔雙側(cè)后足分別承重情況[10]。
肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨表面是否光滑,有無糜爛、潰瘍及骨贅形成;HE染色觀察軟骨表面是否光滑,軟骨細(xì)胞排列是否規(guī)則、軟骨細(xì)胞數(shù)量變化、軟骨表層纖維成分變化、潮線是否完整等;TB染色觀察ECM的著色深淺。使用Mankin's評(píng)分評(píng)估軟骨損傷情況,分?jǐn)?shù)越高說明軟骨損傷越重。
每份關(guān)節(jié)灌洗液稀釋后,分別采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD OD值,根據(jù)試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。
應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并做統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,SOD OD值測(cè)量及Mankin's評(píng)分采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn),雙足平衡支撐力測(cè)量組間比較采用ANOVA檢驗(yàn),組內(nèi)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
N組正?;顒?dòng),無明顯跛行及關(guān)節(jié)腫脹;M組與O3-2組均出現(xiàn)明顯跛行、關(guān)節(jié)活動(dòng)度明顯受限、關(guān)節(jié)腫脹及局部疼痛刺激較為強(qiáng)烈;O3-4組與O3-6組患肢局部對(duì)疼痛刺激反應(yīng)弱,輕微腫脹,活動(dòng)時(shí)輕度跛行。
治療前O3-6、O3-4、O3-2、M與N組相比,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01);O3-6組治療前后相比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),O3-4組治療前后比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),O3-2組治療前后比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05);治療后O3-6、O3-4與O3-2組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),但治療后O3-6、與O3-4組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。醫(yī)用臭氧治療KOA至少4周以上,但不能表明治療時(shí)間越長,效果越好(見表1)。
肉眼觀:N組,關(guān)節(jié)軟骨表 面光滑,無裂紋、糜爛及潰瘍形成,軟骨邊緣無骨贅形成;M組,關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙,可見糜爛及潰瘍形成,內(nèi)側(cè)髁邊緣可見骨贅形成;O3-2組,關(guān)節(jié)軟骨表面可見糜爛及潰瘍形成,軟骨邊緣可見骨贅形成;O3-4組與O3-6組大體觀察:軟骨表面尚光滑,少見糜爛、潰瘍,骨贅形成。
表1 各組兔治療前后左膝關(guān)節(jié)支撐力占雙下肢的比例(n = 6,)
表1 各組兔治療前后左膝關(guān)節(jié)支撐力占雙下肢的比例(n = 6,)
**P < 0.01,與 N 組相比較;#P < 0.05,##P < 0.01,與同組治療前相比較;&&P < 0.01,與治療后O3-2組相比較
組別 左下肢支撐力比例(%)治療前 治療后O3-6 33.59±3.63## 47.70±1.03##&&O3-4 35.09±2.21** 45.31±2.61**#&&O3-2 37.10±3.47** 39.91±2.83 M 37.10±3.47**N 50.36±0.90
光鏡下HE染色:N組(見圖1A),軟骨表面光滑,細(xì)胞排列整齊,軟骨四層結(jié)構(gòu)清晰,無裂隙;M組(見圖1B)軟骨表面粗糙不規(guī)則,四層結(jié)構(gòu)紊亂,軟骨層變薄,軟骨細(xì)胞顯著減少、排列不規(guī)則,可見大量纖維軟骨細(xì)胞及成簇樣細(xì)胞形成,細(xì)胞外基質(zhì)分解,潮線不完整,大量血管翳形成;O3-2組(見圖1C),軟骨表面粗糙不規(guī)則,軟骨四層結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂,大量纖維軟骨細(xì)胞形成,細(xì)胞外基質(zhì)分解,未見明顯潮線,可見血管翳形成;O3-4組(見圖1D),軟骨表面較規(guī)則,四層結(jié)構(gòu)尚清晰,軟骨細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞排列較整齊,可見細(xì)胞輕度增生,軟骨纖維成分均較模型組及O3-2組少,少量軟骨細(xì)胞增生,潮線基本完整;O3-6組(見圖1E),軟骨表面較光滑,四層結(jié)構(gòu)較清楚,軟骨細(xì)胞數(shù)量輕微減少,少量軟骨纖維細(xì)胞形成,潮線較完整。
光鏡下TB染色:N組(見圖2A),ECM著色正常,且均勻著色;M組(見圖2B),ECM著色中至重度降低,著色不均勻或部分不著色;O3-2組(見圖2C),ECM著色明顯降低,且著色不均勻,部分不著色;O3-4組(見圖2D),ECM著色輕度降低,著色較不均;O3-6組(見圖2E),ECM著色較正常,著色較均勻。
根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨病理切片HE及TB染色行Mankin's評(píng)分,M組與O3-2組軟骨細(xì)胞明顯分裂增生,細(xì)胞排列紊亂,潮線模糊,甚至可見血管通過,Mankin's評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;O3-4與O3-6組軟骨細(xì)胞排列稍紊亂,輕度分裂增生,潮線不完整,無明顯血管通過及血管翳形成,Mankin's評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且較接近正常(N組);O3-6和O3-4組與O3-2組相比差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01,見表2)。
O3-6與N組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01);O3-4與N組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05);O3-2與N組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),但O3-2較N組明顯降低;M與N組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。O3-6與M組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01);O3-4與M組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05);O3-2與M組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),但O3-2較N組明顯降低。O3-6和O3-4與O3-2組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01),O3-6與O3-4組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。醫(yī)用臭氧治療KOA至少4周以上且治療時(shí)間越長,該結(jié)果表明治療時(shí)間越長,SOD生成越多(見表3)。
KOA是最常見的慢性退行性疾病,已嚴(yán)重威脅老年人的健康,其致殘率高,導(dǎo)致患者日?;顒?dòng)明顯受限。傳統(tǒng)的治療方法如康復(fù)鍛煉、止痛、消炎、理療、針灸等,都只能暫時(shí)緩解疼痛癥狀,不能控制疾病的進(jìn)展[11,12]; Skou和柯雪茹等[13,14]研究表明,人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后大約20%~30%的患者在疼痛、殘疾及生活質(zhì)量方面幾乎或根本沒有改善,相當(dāng)一部分患者甚至?xí)忌下蕴弁?。而注射治療因其全身副作用小較多應(yīng)用于臨床。常見的注射治療法包括玻璃酸鈉和醫(yī)用臭氧注射治療,玻璃酸鈉注射治療效果顯著,但其價(jià)格昂貴,治療周期較長。近幾年來醫(yī)用臭氧作為一種非藥理性的治療方法已廣泛應(yīng)用于KOA的臨床治療[7,15~17],且療效確切。
KOA患者的正常力學(xué)軸位發(fā)生改變,使關(guān)節(jié)的最大壓力承受部位由外側(cè)脛骨平臺(tái)轉(zhuǎn)移至內(nèi)側(cè)脛骨平臺(tái),導(dǎo)致內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨所承受壓力劇增,再加上去除內(nèi)側(cè)半月板,使關(guān)節(jié)軟骨面之間失去緩沖,直接接觸相互摩擦,從而使軟骨發(fā)生變形損傷。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用經(jīng)典Hulth改良法,通過改變膝關(guān)節(jié)的正常力學(xué)軸位而制模,該法制模穩(wěn)定性好[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療KOA可緩解疼痛、改善膝關(guān)節(jié)功能。醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療4周及6周后,關(guān)節(jié)的雙足平衡支撐力、關(guān)節(jié)軟骨病理變化及Mankin's評(píng)分均無顯著性差異,提示臭氧治療4周及6周療效相當(dāng)。但與臭氧治療2周及模型組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且臭氧治療2周與模型組相比無顯著差異,提示臭氧治療2周療效差,至少治療4周以上才有顯著療效。
KOA的發(fā)病因素很多,而細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix, ECM)的合成與分解代謝的失平衡是OA產(chǎn)生的主要原因之一[12,18]。膝關(guān)節(jié)是由軟骨、軟骨下骨、韌帶、滑膜、肌肉等許多不同的組織組成的生物力學(xué)器官,這些組織的ECM提供了他它們的結(jié)構(gòu)和形式,并定義了他們的生物力學(xué)特性[19]。KOA患者關(guān)節(jié)軟骨及滑液中含有大量的細(xì)胞因子[20],當(dāng)中性粒細(xì)胞受到免疫復(fù)合物、補(bǔ)體等攻擊時(shí),釋放出活性氧(ROS)、NO及超氧化物陰離子(O2-)等氧自由基,這些氧自由基含有未配對(duì)的電子,形成活潑的羥自由基[21],打破機(jī)體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)平衡。羥自由基可激活金屬蛋白酶(Metal Matrix Proteinase, MMP),同時(shí) IL-1、TNF-α 等炎性細(xì)胞因子也可通過刺激軟骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMP,MMP通過降解ECM的重要成分蛋白多糖、骨黏連蛋白、膠原蛋白及軟骨基底膜聚糖,加速軟骨細(xì)胞的衰老與凋亡,導(dǎo)致細(xì)胞不能有效地對(duì)正常的負(fù)荷機(jī)制作出反應(yīng)[22]。但有研究表明,KOA可通過刺激機(jī)體產(chǎn)生抗氧化酶,如SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽等[11],對(duì)抗大量氧自由基,以減輕氧自由基對(duì)軟骨的損傷。醫(yī)用臭氧不僅可以對(duì)抗白細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子引發(fā)的炎癥反應(yīng),也可通過誘導(dǎo)合成SOD、過氧化氫酶等抗氧化酶抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[16],從而改善膝關(guān)節(jié)功能,延緩病情的進(jìn)展。這一機(jī)制符合關(guān)節(jié)自我修復(fù)過程,并能促進(jìn)修復(fù)。
圖1 關(guān)節(jié)軟骨病理切片HE染色
圖2 關(guān)節(jié)軟骨病理切片TB染色
表2 各組兔關(guān)節(jié)軟骨Mankin's評(píng)分(n = 6,)
表2 各組兔關(guān)節(jié)軟骨Mankin's評(píng)分(n = 6,)
*P < 0.05,與 O3-2組相比較
組別 Mankin's評(píng)分O3-6 4.00±0.63*O3-4 4.33±0.52*O3-2 12.67±1.37 M 12.83±0.98
表3 各組兔關(guān)節(jié)灌洗液SOD OD值(n = 6,)
表3 各組兔關(guān)節(jié)灌洗液SOD OD值(n = 6,)
**P < 0.01,與N組相比較; ##P < 0.01,與M組相比較;&&P < 0.01,與O3-2組相比較;△△P < 0.01,與O3-4組相比較;
images/BZ_32_365_2129_502_2193.png)O3-6 0.303±0.013**##&&△O3-4 0.283±0.012*&&O3-2 0.196±0.026**##M 0.262±0.010 N 0.250±0.016組別 SOD OD值(
本研究結(jié)果表明,醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療4周及6周后,關(guān)節(jié)液SOD顯著較M組升高,說明醫(yī)用臭氧可激活機(jī)體抗氧化系統(tǒng),誘導(dǎo)SOD抗氧化酶的生成,對(duì)抗KOA產(chǎn)生的過多的氧自由基,減少細(xì)胞質(zhì)膠原蛋白裂解,抑制MMP的形成,進(jìn)而減少對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨的損傷,同時(shí)也可以使間質(zhì)細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨合成增多,刺激軟骨進(jìn)而纖維原細(xì)胞增殖,起到一定的修復(fù)作用,與先前研究結(jié)果一致[21]。且O3-6組較O3-4組升高(P< 0.05),說明臭氧治療時(shí)間越長,療效越顯著。M組關(guān)節(jié)液SOD含量較正常組升高,但醫(yī)用臭氧治療2周后關(guān)節(jié)液SOD含量較M組顯著降低,導(dǎo)致出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是正常膝關(guān)節(jié)液含有少量SOD,KOA的形成可短期內(nèi)誘導(dǎo)SOD抗氧化酶產(chǎn)生以對(duì)抗氧自由基,臭氧治療2周可能無法有效激活機(jī)體抗氧化系統(tǒng),并且隨著病程延長SOD逐漸消耗,同時(shí)氧自由基不斷增多,激活更多的MMP[11],因此會(huì)出現(xiàn)臭氧治療2周時(shí)關(guān)節(jié)液SOD反而下降的現(xiàn)象;另外,臭氧本身也屬于一種強(qiáng)氧化劑,也可能因?yàn)槎虝r(shí)間臭氧治療對(duì)軟骨的損傷作用大于治療作用。
從目前研究得出,短療程醫(yī)用臭氧治療KOA未見明顯治療效果,是否具有損傷作用需進(jìn)一步研究,下一步可通過在正常家兔膝關(guān)節(jié)注射臭氧,評(píng)估臭氧對(duì)關(guān)節(jié)軟骨是否有損傷作用。臭氧治療KOA應(yīng)不少于4周,并且我們認(rèn)為隨著治療時(shí)間越長效果可能會(huì)越好,但從O3-6組與O3-4組的Mankin's評(píng)分及雙足平衡支撐力占比的結(jié)果比較,兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析原因可能因?yàn)闃颖玖枯^小所致,下一步可通過增加樣本量或延長治療時(shí)間探討醫(yī)用臭氧治療時(shí)間對(duì)KOA的影響。
綜上所述,醫(yī)用臭氧關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療KOA不少于4周時(shí),對(duì)修復(fù)關(guān)節(jié)損傷、改善膝關(guān)節(jié)功能具有顯著療效,在臨床上對(duì)醫(yī)用臭氧注射治療KOA的最佳療程具有指導(dǎo)意義。