毛艷萍，田 里，陳 勝，張雅怡，王越興

1)深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東深圳518060；2)深圳市水務(wù)(集團(tuán))有限公司，廣東深圳518000

抗生素一直被認(rèn)為是20世紀(jì)的醫(yī)學(xué)奇跡，現(xiàn)在各種抗生素已被廣泛用于人類和動(dòng)物的醫(yī)療，然而濫用抗生素可能會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中抗生素耐藥細(xì)菌(antibiotic resistant bacteria, ARB)和抗生素耐藥基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的廣泛出現(xiàn)和傳播[1]．在抗生素臨床應(yīng)用前，微生物群體中就已經(jīng)存在ARGs且來(lái)源廣泛．微生物耐藥性是獨(dú)立于人類社會(huì)自然發(fā)生的，但在人類和動(dòng)物中濫用抗生素會(huì)加速耐藥性的產(chǎn)生[2]．城市污水處理廠(sewage treatment plants, STPs)中ARB和ARGs的分布和傳播是現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)之一，因?yàn)槠浣邮樟烁鞣N家庭污水和醫(yī)療廢水，被認(rèn)為是環(huán)境中ARB和ARGs的重要來(lái)源之一[3-4]．現(xiàn)已在STPs中檢測(cè)到攜帶ARGs的人或動(dòng)物病原體，如具有抗生素耐藥性的氣單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌科和假單胞菌屬等[5-6]．LI等[7-8]研究表明，STPs顯著改變了ARGs在環(huán)境中的豐度和分布，它排放的廢水是ARGs在自然環(huán)境中的主要人為來(lái)源，因此STPs被認(rèn)為是將ARGs傳播到自然環(huán)境中的重要節(jié)點(diǎn)，開(kāi)展STPs中抗生素耐藥性的研究具有重要意義．

四環(huán)素是使用量較大的抗生素之一，持續(xù)地使用四環(huán)素導(dǎo)致四環(huán)素耐藥細(xì)菌和耐藥基因不斷增加．但是，目前對(duì)四環(huán)素類抗生素在STPs中的去除的影響因素，以及對(duì)微生物群落的影響機(jī)制尚不十分明確[9-12]．大腸桿菌常被用作腸源性細(xì)菌的模式菌株和糞便指示菌，被用于評(píng)估水域中微生物污染的水平[13]，并被作為模式菌株來(lái)研究自然環(huán)境中的抗生素耐藥性的來(lái)源及ARGs在環(huán)境微生物中的傳播規(guī)律[14]．研究STPs中大腸桿菌的四環(huán)素耐藥性及其耐藥基因情況，可指示環(huán)境中抗生素對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響．

目前，對(duì)ARGs的檢測(cè)方法已從最初普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)對(duì)少數(shù)耐藥基因進(jìn)行定性，到熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)一部分已知的耐藥基因進(jìn)行定量，再發(fā)展到高通量PCR技術(shù)對(duì)大量耐藥基因進(jìn)行高靈敏度定量分析．現(xiàn)有的基于高通量測(cè)序技術(shù)的宏基因組學(xué)技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)新型耐藥基因，發(fā)掘不可培養(yǎng)微生物的全部基因信息方面發(fā)揮了巨大作用[15-17]．因此，越來(lái)越多針對(duì)STPs中ARGs的研究?jī)A向于采用宏基因組學(xué)技術(shù)，或多種技術(shù)手段相結(jié)合的方法來(lái)開(kāi)展[18]．

本研究以中國(guó)深圳市的兩座典型STPs進(jìn)水和二沉池出水為研究對(duì)象，分別分離得到大腸桿菌菌株，分析各菌株在添加四環(huán)素前后培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，得到四環(huán)素的耐藥菌和敏感菌，再利用PCR技術(shù)和宏基因組學(xué)方法對(duì)耐藥菌和敏感菌的四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行分析，探討典型STPs不同的處理工藝對(duì)四環(huán)素耐藥菌和耐藥基因的傳播是否存在抑制作用，從而對(duì)比兩種不同工藝的處理效果．同時(shí)研究四環(huán)素耐藥菌基因型與表型之間的關(guān)系，為耐藥菌的快速檢測(cè)提供潛在的指示性基因，也為進(jìn)一步挖掘新型的耐藥基因奠定基礎(chǔ)，為污水處理系統(tǒng)中耐藥菌的環(huán)境行為和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考．

1 材料與方法

1.1 水樣采集

2018-03-28使用不銹鋼浸入式水樣采集器采集深圳市N污水處理廠和F污水處理廠的進(jìn)水和二沉池出水．F廠采用改進(jìn)型的A2O(厭氧-缺氧-好氧)工藝，N廠采用改進(jìn)的UCT(modified University of Capetown, MUCT)工藝．每個(gè)水樣采集500 mL并置于采集瓶中，采集前先用水樣潤(rùn)洗采集器和采集瓶．水樣分別標(biāo)記為N污水處理廠進(jìn)水(NJ)、N污水處理廠二沉池出水(NC)、F污水處理廠進(jìn)水(FJ)和F污水處理廠二沉池出水(FC)．水樣采集完畢，用封口膜封住瓶口，立刻送回實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃冰箱中，并于24 h內(nèi)開(kāi)始大腸桿菌的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)．

1.2 培養(yǎng)基的配制

首先配置麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，用于分離和篩選水樣中的大腸桿菌．利用電子分析天平稱取12.50 g麥康凱瓊脂培養(yǎng)基粉末，溶于250 mL超純水中，于121 ℃的立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器中滅菌15 min．滅菌完成后，待滅菌器與外界壓力差為0時(shí)，取出培養(yǎng)基并置于超凈工作臺(tái)中冷卻至約70 ℃，再往每個(gè)培養(yǎng)皿中倒15 mL培養(yǎng)基，冷卻靜置12 h后備用．

配置LB(Luria Broth)液體培養(yǎng)基用于大腸桿菌菌種的保存．分別稱取胰蛋白胨(Tryptone)2.00 g、酵母提取物(Yeast extract)1.00 g和氯化鈉2.00 g，并溶于200 mL超純水中，于121 ℃滅菌20 min，所得培養(yǎng)基置于超凈工作臺(tái)中冷卻至室溫備用．

為檢測(cè)大腸桿菌中的四環(huán)素耐藥菌和敏感菌，配置質(zhì)量濃度為10 mg/L四環(huán)素鹽酸鹽的LB液體培養(yǎng)基．首先配制質(zhì)量濃度為400 mg/L四環(huán)素鹽酸鹽溶液作為母液．稱取4.00 mg四環(huán)素鹽酸鹽粉末(Sigma，分析純)，用超純水定容到10 mL，并經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾．然后配制質(zhì)量濃度為10 mg/L四環(huán)素鹽酸鹽的LB液體培養(yǎng)基，移取250 μL質(zhì)量濃度為400 mg/L 四環(huán)素鹽酸鹽溶液于已滅菌的9 750 μL LB液體培養(yǎng)基中，混勻備用．

1.3 大腸桿菌的分離與保存

為分離大腸桿菌菌株，使用稀釋1 000倍的NJ和FJ水樣分別在裝有麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上涂布培養(yǎng)．NC和FC水樣由于經(jīng)過(guò)污水處理廠處理后微生物濃度大幅降低，故可直接使用未稀釋的出水分別進(jìn)行大腸桿菌的培養(yǎng)分離．分離得到的大腸桿菌菌株保存于96孔板中．在超凈工作臺(tái)中向96孔板每孔添加75 μL的LB液體培養(yǎng)基，利用已滅菌的牙簽挑取培養(yǎng)基上分離較好的紅色單菌落分別接種于96孔板中，并留出3個(gè)孔不添加菌種，作為空白對(duì)照，用封口膜封口．將96孔板置于225 r/min、37 ℃的全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚，ZQZY-70BS)中培養(yǎng)12 h，每個(gè)孔對(duì)應(yīng)一株大腸桿菌．將50%甘油置于121 ℃的立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器中滅菌20 min，滅菌后往每個(gè)孔添加75 μL的50%甘油，輕輕搖勻，用封口膜封口，再將96孔板置于-20 ℃ 冰箱中保存，作為母板備用．

1.4 菌種的活化與生長(zhǎng)曲線的繪制

利用甘油保存的菌株由于生長(zhǎng)活性被抑制，不能直接用于生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)，要先通過(guò)活化實(shí)驗(yàn)恢復(fù)其活性．在全新的96孔板中都添加150 μL LB液體培養(yǎng)基，對(duì)應(yīng)地往各孔分別接種1.5 μL甘油保存的菌株，用封口膜封口，置于37 ℃的全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h．

待菌株活性恢復(fù)后，使用多功能微孔板檢測(cè)儀(BioTek，Synergy HTX，美國(guó))測(cè)其每隔30 min在600 nm處的光密度(D(600))， 連續(xù)測(cè)定12 h．培養(yǎng)基分別采用純LB液體培養(yǎng)基和添加10 mg/L四環(huán)素鹽酸鹽的LB液體培養(yǎng)基．以時(shí)間為橫坐標(biāo)，D(600)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線．所有大腸桿菌菌株在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線測(cè)定均做3個(gè)平行組．對(duì)比添加四環(huán)素鹽酸鹽溶液前后生長(zhǎng)曲線的變化，作為判斷該大腸桿菌是否具有四環(huán)素耐藥性的依據(jù)．

1.5 DNA的提取和質(zhì)量測(cè)定

為獲取大腸桿菌的DNA，在梯度PCR儀(Biometra TOne 96G, Bio-Rad, 美國(guó))通過(guò)95 ℃和4 ℃的預(yù)變性處理后，使用小型Sigma高速離心機(jī)以4 000 r/min離心1 min得到上清液，溫度變化促使菌株破壁，將DNA釋放并溶于上清液中．DNA的濃度和純度使用多功能微孔板檢測(cè)儀和核酸測(cè)定儀(Qubit 3.0，Life，美國(guó))測(cè)定．DNA的完整性通過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定．

1.6 四環(huán)素耐藥基因的測(cè)定

利用PCR擴(kuò)增法檢測(cè)大腸桿菌中四環(huán)素耐藥基因的分布，選擇擴(kuò)增的四環(huán)素耐藥基因?yàn)閠et(A)、tet(B)、tet(L)和tet(M)． 其中，tet(A)和tet(B)是典型且檢出率較高的外排泵基因，外排泵是將細(xì)胞內(nèi)的毒性底物(包括大多數(shù)臨床使用的抗生素)從細(xì)胞內(nèi)排出到外部環(huán)境中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[19]．tet(L)是主要存在于小的傳遞質(zhì)粒中的典型基因，tet(M)是典型的核糖體保護(hù)蛋白的編碼基因[20]．本研究選擇這4個(gè)耐藥基因進(jìn)行擴(kuò)增，其引物信息如表1[21-22]．本次實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增的體系為30 μL，包括15 μL 2倍Premix、2 μL F-Primer(10 μmol/L)、2 μL R-Primer(10 μmol/L)、2 μL DNA、9 μL 水．PCR熱循環(huán)過(guò)程為：首先于94 ℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)中，94 ℃保持1 min，55 ℃或56 ℃退火1 min 和72 ℃ 延伸1.5 min；最后72 ℃延伸10 min．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳法來(lái)初步判斷是否存在該耐藥基因目標(biāo)片段．

表1 四種四環(huán)素耐藥基因的PCR引物的相關(guān)信息[21-22]

2 結(jié)果與討論

2.1 大腸桿菌對(duì)四環(huán)素耐藥性的表型分析

從4個(gè)水樣NJ、NC、FJ和FC中分別得到86、46、88和52株大腸桿菌，使用多功能微孔板檢測(cè)儀，測(cè)繪其在LB液體培養(yǎng)基和四環(huán)素鹽酸鹽質(zhì)量濃度為10 mg/L的LB液體培養(yǎng)基的12 h生長(zhǎng)曲線，通過(guò)對(duì)比添加四環(huán)素前后的生長(zhǎng)曲線，分析得到NJ、NC、FJ和FC對(duì)四環(huán)素耐藥性表型檢出率分別為36%、4%、23%和8%．兩座污水處理廠二沉池出水大腸桿菌中四環(huán)素耐藥菌的檢出率均明顯低于進(jìn)水，說(shuō)明所選取的兩個(gè)典型污水處理廠通過(guò)對(duì)污水進(jìn)行2級(jí)處理后，能顯著降低四環(huán)素耐藥菌豐度，有效抑制了四環(huán)素耐藥菌的傳播，這與現(xiàn)有報(bào)道結(jié)果基本相同[25]．采用MUCT工藝的FC水樣四環(huán)素耐藥菌檢出率降低了32%；采用改進(jìn)型的A2O工藝的F污水處理廠的出水四環(huán)素耐藥菌檢出率降低了15%，初步說(shuō)明N污水處理廠的MUCT工藝，與F污水處理廠的A2O工藝相比，前者對(duì)四環(huán)素耐藥菌豐度的降低和傳播的抑制效果更好．

2.2 四環(huán)素耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

由于原水樣中大腸桿菌數(shù)較多，故從NJ水樣的耐藥菌和敏感菌各隨機(jī)挑選6株大腸桿菌，從NC水樣中挑選2株耐藥菌(分離到的全部耐藥菌)和6株敏感菌，從FJ水樣中的耐藥菌和敏感菌各隨機(jī)挑選6株大腸桿菌，從FC水樣中挑選4株耐藥菌(分離到的全部耐藥菌)和6株敏感菌，共耐藥菌18株和敏感菌24株，對(duì)四環(huán)素耐藥基因tet(A)、tet(B)、tet(L)和tet(M)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，再對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳法來(lái)判斷是否存在耐藥基因的目標(biāo)片段．四環(huán)素耐藥基因分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2，其中檢出率指含該耐藥基因菌株占總菌株數(shù)的比例，陽(yáng)性檢出率指含該耐藥基因的耐藥菌株數(shù)占總耐藥菌株數(shù)的比例．從表2可見(jiàn)，4個(gè)樣品中的耐藥菌普遍能檢測(cè)到耐藥基因，且部分耐藥菌含有多個(gè)耐藥基因．其中，tet(A)的陽(yáng)性檢出率高達(dá)77.8%，說(shuō)明它作為四環(huán)素外排泵基因，可能在具有四環(huán)素抗性的大腸桿菌中廣泛分布，在四環(huán)素耐藥性方面起到主要作用．事實(shí)上目前已有研究得到了類似結(jié)論[26]，如FAN等[27]在世界范圍內(nèi)廣泛收集了107株耐四環(huán)素大腸桿菌分離株，采取多重PCR的方法檢測(cè)四環(huán)素耐藥基因，發(fā)現(xiàn)其中的49.5%含tet(A)基因，35.5%含tet(B)基因，5.6%含tet(C)基因，1.9%含tet(D)基因．

表2 四環(huán)素耐藥基因分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

1)檢出率指含該耐藥基因菌株占總菌株數(shù)的比例；

2)陽(yáng)性檢出率指含該耐藥基因的耐藥菌株數(shù)占總耐藥菌株數(shù)的比例

值得注意的是，4個(gè)樣品中有7株敏感菌也檢測(cè)到了耐藥基因，但它們并未表現(xiàn)出抗性，推測(cè)其耐藥基因未表達(dá)．同時(shí)，有1株耐藥菌并未檢測(cè)到耐藥基因，這可能是因?yàn)樗暨x檢測(cè)的耐藥基因數(shù)量不夠多，或這株耐藥菌存在其他抵抗四環(huán)素的機(jī)制，亦或因?yàn)檫@株耐藥菌攜帶的耐藥基因仍屬未被發(fā)現(xiàn)類，需要進(jìn)一步探索新的四環(huán)素耐藥基因．

表3 四環(huán)素耐藥表型與基因型分析1)

2.3 宏基因組的結(jié)果分析

為進(jìn)一步揭示四環(huán)素耐藥菌和敏感菌的耐藥基因，并與PCR的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，采用宏基因組學(xué)方法對(duì)所選取的大腸桿菌菌株進(jìn)行高通量測(cè)序．通過(guò)NovaSeq平臺(tái)測(cè)序和序列質(zhì)量控制，每個(gè)提取的DNA樣品得到19 954～77 434條序列，力求每個(gè)大腸桿菌菌株的基因組測(cè)序覆蓋度達(dá)到10倍以上．用ARG-OAP(v2.0)平臺(tái)分析序列，得到四環(huán)素耐藥基因的類型和數(shù)量(表4)．由表4可見(jiàn)，在這4個(gè)水樣中，耐藥菌和敏感菌均檢測(cè)到tet(A)， 耐藥菌中所含的耐藥基因的類型和數(shù)量較敏感菌更多．此外，樣品中除了檢測(cè)到四環(huán)素耐藥基因外，還檢測(cè)到大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和磺胺類等多種抗生素耐藥基因．與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，宏基因組學(xué)方法能更快且更高效地檢測(cè)到多種四環(huán)素抗性基因，為后續(xù)研究其他抗生素的耐藥基因提供了方法．目前已有對(duì)于不同耐藥基因聯(lián)合作用的相關(guān)研究[28]，但不同耐藥基因?qū)股啬退幮缘谋磉_(dá)有何具體影響，以及耐藥基因聯(lián)合作用的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究．

表4 宏基因組序列分析結(jié)果1)

1)tet(E)、tet(G)、tet(H)、tet(J)、tet(O)、tet(P)、tet(Q)、tet(R)、tet(S)、tet(T)、tet(U)、tet(V)、tet(W)、tet(X)、tet(Y)、tet(Z)、otr(A)、tcr(3)、tet(31)、tet(32)、tet(34)、tet(35)、tet(36)、tet(37)、tet(39)、tet(40)、tet(41)、tet(43)和tet(44)等四環(huán)素類耐藥基因均未檢測(cè)到．

通過(guò)對(duì)比分析兩個(gè)STPs的進(jìn)出水樣品發(fā)現(xiàn)，采用改進(jìn)型的A2O工藝和MUCT工藝，都能顯著降低污水中耐藥基因的比例．其中，tet(A)在耐藥菌和敏感菌中均廣泛存在，故tet(A)不適合作為檢測(cè)四環(huán)素耐藥菌指示性基因．然而，tet(B)、tet(C)、tet(D)和tet(M)存在于大多數(shù)的四環(huán)素耐藥菌中，雖然在敏感菌中未檢出，仍可作為快速檢測(cè)四環(huán)素耐藥菌的潛在指示性基因．部分耐藥菌含有tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(L)和tet(M)中的多個(gè)耐藥基因，因此仍需進(jìn)一步研究多耐藥基因的聯(lián)合作用及其機(jī)制．

本研究采用兩種方法對(duì)四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，即基于高通量測(cè)序技術(shù)的宏基因組學(xué)與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，檢測(cè)結(jié)果基本一致，表明四環(huán)素耐藥基因與四環(huán)素耐藥性有明顯相關(guān)性．采過(guò)宏基因組學(xué)方法能同時(shí)檢測(cè)到樣品中攜帶的多種抗生素抗性基因．運(yùn)用宏基因組學(xué)和多組學(xué)方法相結(jié)合的手段研究STPs中耐藥基因的源與匯是目前的研究熱點(diǎn)[29]，下一步我們將基于本研究成果，探究大腸桿菌其他主要抗生素的耐藥性與其耐藥基因的關(guān)系，并探討不同耐藥基因之間聯(lián)合作用的機(jī)理．

結(jié) 語(yǔ)

本研究所選的兩個(gè)典型城市污水處理廠分別采用改進(jìn)型A2O工藝和MUCT工藝處理污水后，四環(huán)素耐藥菌和耐藥基因檢出率明顯降低，說(shuō)明這兩種處理工藝均能有效降低四環(huán)素耐藥菌和耐藥基因的豐度，顯著抑制了四環(huán)素耐藥菌的傳播．檢測(cè)結(jié)果表明，四環(huán)素耐藥菌的表型與基因型顯著相關(guān)，tet(A)在耐藥菌和敏感菌中都有檢出，tet(B)、tet(C)、tet(D)和tet(M)在大多數(shù)四環(huán)素耐藥菌中檢出，在敏感菌中沒(méi)有檢出，可作為快速檢測(cè)四環(huán)素耐藥菌的潛在指示性基因．然而少數(shù)耐藥菌并未檢測(cè)到耐藥基因，需進(jìn)一步探究新型的四環(huán)素耐藥基因或者新的四環(huán)素耐藥機(jī)制．樣品中有部分敏感菌也檢測(cè)到耐藥基因，推測(cè)這些敏感菌的耐藥基因未表達(dá)．此外，四環(huán)素耐藥菌中還含有其他多種抗生素的耐藥基因．未來(lái)我們將繼續(xù)研究不同耐藥基因之間的相互作用機(jī)理，通過(guò)進(jìn)一步解析污水處理廠中耐藥菌和耐藥基因的分布和傳播的影響因素，為評(píng)價(jià)其對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康的影響及潛在風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)．