徐杰 黃建忠 李力

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)院，福州 350108）

與傳統(tǒng)的以“模型導(dǎo)向”科研方式不同，基因組學(xué)研究以其高度的系統(tǒng)性，以數(shù)據(jù)為導(dǎo)向，開(kāi)創(chuàng)了全新的研發(fā)方法。20世紀(jì)以來(lái)高通量基因測(cè)序技術(shù)的建立直接推動(dòng)了生物信息學(xué)的發(fā)展［1］，微生物基因組測(cè)序的成本不斷降低，周期縮短，越來(lái)越多的生物遺傳信息被公布，公共數(shù)據(jù)庫(kù)積累了大量的基因組序列數(shù)據(jù)，后基因組時(shí)代來(lái)臨［2］。在此基礎(chǔ)上，人們通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)不同基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別鑒定、功能分析、相互關(guān)系和可能的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了大量未知的可能與合成新型次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因簇，這為直接以基因?yàn)閷?dǎo)向替代傳統(tǒng)的以生物活性為導(dǎo)向，尋找潛在藥物提供了可能［3］。

生物體次級(jí)代謝產(chǎn)物是抗生素的主要來(lái)源，其頻繁的使用會(huì)加速細(xì)菌適應(yīng)性進(jìn)化而產(chǎn)生免疫能力。研究證實(shí)，在對(duì)某一藥物產(chǎn)生抗性的同時(shí)，細(xì)菌對(duì)其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或衍生型藥物的抗藥性也會(huì)得到提高［4］。自 1979 年 Campbell［5］從 40000 份土壤樣品發(fā)現(xiàn)新型抗生素阿維菌素后至今的40年內(nèi)，尚未找到其它有重要應(yīng)用價(jià)值的活性化合物，以生物活性為導(dǎo)向的舊有藥物篩選方式陷入瓶頸。挖掘藥物的關(guān)鍵在于避免已知化合物的過(guò)度復(fù)篩，能否發(fā)現(xiàn)新藥物很大程度上取決于挖掘過(guò)程中在概率上的盲目程度。用科學(xué)理論指導(dǎo)開(kāi)發(fā)方向，可降低成本和周期，避免已知化合物的重復(fù)研究。微生物中負(fù)責(zé)編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的酶基因通常成簇存在，通過(guò)NCBI中基礎(chǔ)局部比對(duì)搜索工具（BLAST）搜索相關(guān)酶類(lèi)，并通過(guò)基因預(yù)測(cè)算法，如Augustus發(fā)現(xiàn)未知的生物合成基因簇，通過(guò)信息學(xué)工具可預(yù)測(cè)出產(chǎn)物結(jié)構(gòu)以及可能含有的新藥物作用靶點(diǎn)［6-8］，這為新藥開(kāi)發(fā)提供了新方向。

次級(jí)代謝產(chǎn)物是一種具有多樣化結(jié)構(gòu)的小分子，它在微生物體內(nèi)不是為了滿足機(jī)體基本生長(zhǎng)需要而產(chǎn)生，而是作為一種“武器”來(lái)對(duì)抗復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境并保證在與其它微生物的競(jìng)爭(zhēng)中處于優(yōu)勢(shì)地位。然而編碼此類(lèi)化合物的基因往往只在特定環(huán)境下才表達(dá)，常規(guī)培養(yǎng)條件下處于沉默狀態(tài)或表達(dá)量低，難以分離純化和投入工業(yè)生產(chǎn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示微生物中表達(dá)并分離出對(duì)應(yīng)代謝產(chǎn)物的合成基因只占總數(shù)的10%左右，微生物資源在新藥研發(fā)領(lǐng)域的潛力遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有被開(kāi)發(fā)出來(lái)，還需要不斷地進(jìn)行探索［9］?；蚪M挖掘是指通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的可能編碼高價(jià)值天然產(chǎn)物的基因進(jìn)行測(cè)序，了解基因表達(dá)翻譯的控制機(jī)制并通過(guò)一系列手段將其激活表達(dá)，分離純化出相應(yīng)目的產(chǎn)物后解析結(jié)構(gòu)并進(jìn)行生物活性測(cè)試的技術(shù)。與傳統(tǒng)方法相比它將整個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)化為編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物基因序列數(shù)據(jù)在培養(yǎng)基上的變現(xiàn)及分離柱上的純化，讓整個(gè)流程處于分子生物學(xué)的指導(dǎo)［10］，研究主要包含以下方向。

1 基因組挖掘

1.1 傳統(tǒng)基因組學(xué)挖掘

基因組學(xué)挖掘天然產(chǎn)物的關(guān)鍵在于尋找到有價(jià)值的合成基因，酶作為生物體內(nèi)代謝活動(dòng)的催化劑在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成途徑中發(fā)揮了重要作用，催化同一類(lèi)型反應(yīng)的酶系在分子結(jié)構(gòu)上具有保守性，核心往往有一個(gè)高度重復(fù)的氨基酸序列，直接以負(fù)責(zé)目的代謝產(chǎn)物的合成酶作為靶點(diǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析含有關(guān)聯(lián)序列的酶基因，設(shè)計(jì)交聯(lián)探針或PCR引物即可定向選擇具有合成潛力的基因。最典型的就是目前研究比較深入的聚酮化合物合酶（Polyketidesynthase，PKS）和非核糖體肽合酶（Nonribsomal peptide synthetases，NRPS）， 其 分子結(jié)構(gòu)是由多個(gè)結(jié)構(gòu)單元組成，線性排列的負(fù)責(zé)相應(yīng)結(jié)構(gòu)單元的模塊化合成酶基因組成了完整的生物合成基因簇。Sun等［11］對(duì)海洋黏細(xì)菌Haliangium ochraceum SMP-2進(jìn)行基因組挖掘，發(fā)現(xiàn)了一種聚酮化合物-非核糖體肽雜合化合物Haliamide 1（圖1），通過(guò)核磁共振和HR-MS對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征和喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其生物合成的結(jié)構(gòu)單元為苯甲氨酸鹽、丙氨酸和丙氨酸鹽，從而建立了鹵胺合成的生物模型，活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)Hela-S3細(xì)胞具有毒性。

圖1 Haliamide 1結(jié)構(gòu)

1.2 比較基因組學(xué)挖掘

比較基因組學(xué)是基于基因組圖譜和測(cè)序技術(shù)，對(duì)已知基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，了解基因功能、表達(dá)機(jī)理、物種進(jìn)化的科學(xué)。在研究目的蛋白基因的同時(shí)，關(guān)注完整的基因簇或基因鄰域，分析不同分子間相關(guān)性來(lái)挖掘未知酶系和其體內(nèi)的生物合成機(jī)制，促進(jìn)新化合物的發(fā)現(xiàn)。將已知基因序列的功能基因簇通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)與其它已測(cè)序的生物遺傳圖譜進(jìn)行局部共線性比對(duì)驗(yàn)證是否具有類(lèi)似的合成路徑，挖掘已知物種未發(fā)現(xiàn)的合成潛力。通過(guò)將編碼目標(biāo)修飾蛋白的抗藥性基因與未表征次級(jí)代謝合成基因簇孤兒BGCs相關(guān)聯(lián)，基因組定向挖掘的過(guò)程中，可預(yù)測(cè)路徑特異性小分子的生物學(xué)功能。Tang等［12］對(duì)86個(gè)鹽孢菌基因組的全基因組查詢(xún)，獲得與天然產(chǎn)物BGCs共定位的管家基因，篩選出一個(gè)可能具有脂肪酸合成酶抗性基因的PKS-NRPS雜合BGC（TLM），從而推測(cè)出硫代四酸類(lèi)抗生素的合成途徑。

1.3 宏基因組學(xué)

宏基因組是指環(huán)境中所有微生物遺傳物質(zhì)的總和，包含可培養(yǎng)和未可培養(yǎng)微生物遺傳物質(zhì)基因，通過(guò)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，繞過(guò)培養(yǎng)難點(diǎn)直接在基因?qū)哟窝芯课纯膳囵B(yǎng)微生物的合成潛力，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因和抗生素機(jī)制，完善藥物靶點(diǎn)，以及鑒定在不同生長(zhǎng)環(huán)境下對(duì)細(xì)菌、真菌生長(zhǎng)起重要作用的基因，從而豐富基因庫(kù)來(lái)源［13］。操作包括從環(huán)境中提取樣品DNA，高通量測(cè)序后選擇合適的載體拼接修飾，導(dǎo)入宿主細(xì)胞激活表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組網(wǎng)絡(luò)的功能驗(yàn)證與開(kāi)發(fā)利用。Levin等［14］通過(guò)結(jié)合基因組學(xué)和生物學(xué)知識(shí)，將合成具有保守氨基酸結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)基因和正常人體的消化道菌群數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，分析了甘氨酰自由基酶（GRE）家族，以甘氨酸為中心用自由基進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，確定了一個(gè)新的在生產(chǎn)L-脯氨酸通路上起重要作用的反式 4 羥基脯氨酸脫水酶，它在所有腸道微生物宏基因組樣本中都能發(fā)現(xiàn)，從而揭示了反式 4 羥基 L 脯氨酸的常規(guī)代謝途徑。

2 沉默基因的表達(dá)

通過(guò)基因組挖掘的方法能夠準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)大量與合成次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)的基因簇，然而多數(shù)基因在常規(guī)培養(yǎng)條件下處于沉默狀態(tài)，必須在特定生理環(huán)境下或外來(lái)細(xì)菌病毒入侵引起免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)才會(huì)激活。這些基因由于常規(guī)條件下不表達(dá)，因而更有可能在人為控制下激活產(chǎn)生骨架新穎、生物活性高的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如何選用適當(dāng)?shù)姆椒せ钸@些“沉默代謝途徑”是繼基因組挖掘后的重要研究?jī)?nèi)容，也是最終獲得潛在藥物資源的關(guān)鍵?，F(xiàn)階段激活沉默基因的策略如下。

2.1 改變培養(yǎng)條件、共培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)

通過(guò)改善培養(yǎng)基組分、溫度、pH、光照條件、氣壓、氧濃度、微量元素，或與合適病原菌、競(jìng)爭(zhēng)菌共培養(yǎng)，提高生存壓力刺激沉默基因表達(dá)。某些能夠改變微生物表觀遺傳途徑的小分子物質(zhì)，如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、組蛋白去乙酰化抑制劑能夠影響DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA干擾等從而影響微生物對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成調(diào)控，誘導(dǎo)沉默基因表達(dá)。Bode等［15］研究小組通過(guò)改變培養(yǎng)條件從6個(gè)微生物中分離出超過(guò)25個(gè)結(jié)構(gòu)類(lèi)型的100多個(gè)化合物；Scherlach等［16］發(fā)現(xiàn)Aspergillusnidulans這種產(chǎn)生在水稻培養(yǎng)基但不產(chǎn)生在其它介質(zhì)中的新型喹諾林類(lèi)生物堿；Shwab等［17］發(fā)現(xiàn)編碼黑曲霉組蛋白去乙?；福℉DAC）的hdaA缺失，導(dǎo)致兩個(gè)端粒近端基因簇的轉(zhuǎn)錄激活，隨后相應(yīng)的分子（毒素和抗生素）水平增加。

2.2 調(diào)控基因改造

次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇是復(fù)雜的，它不只是單純含有合成化合物的基因，同時(shí)還包含大量參與基因表達(dá)，控制代謝途徑的調(diào)節(jié)基因。通過(guò)設(shè)計(jì)方案對(duì)調(diào)節(jié)基因進(jìn)行敲除、阻遏、或使其過(guò)表達(dá)，都會(huì)影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成效率。選擇性過(guò)表達(dá)正調(diào)控因子和降低負(fù)調(diào)控因子表達(dá)減少反饋抑制可促進(jìn)基因的激活和代謝產(chǎn)物在發(fā)酵液中的積累［18］。Laureti等［19］過(guò)表達(dá)Streptomyces ambofaciens中的特異性調(diào)節(jié)基因Sam R0484激活了一個(gè)沉默的聚酮合酶的次級(jí)代謝基因簇表達(dá)，最終得到了新型的具有抗腫瘤活性的化合物Stambomycins。Molloy等［20］通過(guò)滅活推測(cè)的TetR轉(zhuǎn)錄抑制因子 arPRII等手段對(duì)編碼化合物基因進(jìn)行鑒定，質(zhì)譜和核磁共振光譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征證實(shí)其是新的生物堿類(lèi)化合物，生物活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)對(duì)于黏菌的生長(zhǎng)和菌落分化具有負(fù)面作用，其中一些抗菌活性較弱。

2.3 核糖體工程

與微生物在營(yíng)養(yǎng)缺陷時(shí)的應(yīng)激機(jī)制相似，核糖體工程就是通過(guò)以不同的微生物抗性突變?yōu)榘袠?biāo)，高效獲得次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力得到提高的突變株的推理育種新方法。核糖體不僅是微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成位點(diǎn)，還可以與藥物結(jié)合抑制蛋白質(zhì)合成從而調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑，如鏈霉素和氯霉素可分別與核糖體30S亞基和核糖體50S亞基結(jié)合。在微生物的穩(wěn)定生長(zhǎng)期，與合成次級(jí)代謝產(chǎn)物相關(guān)基因的大量表達(dá)取決于此時(shí)的核糖體功能。以生物體中核糖體蛋白、RNA聚合酶RNAP、轉(zhuǎn)錄因子為作用靶點(diǎn)，通過(guò)在核糖體蛋白編碼基因上引入定點(diǎn)修飾和突變，改造核糖體結(jié)構(gòu)來(lái)改變相關(guān)催化酶的生物學(xué)性質(zhì)，可能會(huì)激活相關(guān)沉默的抗生素合成基因，影響代謝途徑［21-23］。如 Dong等［24］通過(guò)核糖體技術(shù)使海洋真菌雜色曲霉菌ZBY3獲得耐新霉素抗性后發(fā)現(xiàn)6種新型抗腫瘤物質(zhì)；Yi等［25］通過(guò)同樣手段在紫草青霉G59中分離到一種新的環(huán)戊酮硫化物。

2.4 異源表達(dá)與強(qiáng)啟動(dòng)子替換

異源表達(dá)一般指異源蛋白表達(dá)，對(duì)于具有復(fù)雜調(diào)控機(jī)制或不可培養(yǎng)微生物的基因，將目的合成基因簇整合插入到質(zhì)粒、黏粒、人工染色體等載體后在異源宿主內(nèi)表達(dá)。該方法可繞過(guò)自身復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，減少原有產(chǎn)物含量積累造成的反饋抑制和對(duì)特定表達(dá)環(huán)境的需求，對(duì)生長(zhǎng)緩慢的菌種可明顯降低生產(chǎn)周期。目前用于挖掘新化合物的異源表達(dá)流程通常為：大腸桿菌擴(kuò)增載體、酵母細(xì)胞對(duì)目的片段進(jìn)行拼接、曲霉作為宿主細(xì)胞對(duì)目的基因進(jìn)行表達(dá)［26］。啟動(dòng)子是位于起始位點(diǎn)上游能增加或降低基因轉(zhuǎn)錄速率，被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特異性結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列，本身不被轉(zhuǎn)錄。在沉默基因簇前添加或替換誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子，構(gòu)建新的調(diào)控機(jī)制，通常可刺激基因激活提高表達(dá)量，利于最終工業(yè)生產(chǎn)，常見(jiàn)的有構(gòu)巢曲霉A的持家啟動(dòng)子gpdA，黑曲霉作為宿主異源表達(dá)時(shí)的常用強(qiáng)啟動(dòng)子glaA等［27-30］。Wang等［31］發(fā)現(xiàn)在工程大腸桿菌中表達(dá)編碼嗜熱鏈球菌雙功能谷胱甘肽合成酶基因GshF，分批發(fā)酵分離積累的GSH達(dá)到以往表達(dá)最高水平。黃開(kāi)華等［32］利用蛹蟲(chóng)草自身強(qiáng)啟動(dòng)子，構(gòu)建天蠶菌素抗菌肽過(guò)表達(dá)載體，介導(dǎo)農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，在蛹蟲(chóng)草中成功表達(dá)，活性測(cè)定和抑菌實(shí)驗(yàn)表明相較于野生型其生物學(xué)活性明顯提高。Saha等［33］通過(guò)啟動(dòng)子工程和異源表達(dá)對(duì)海洋鏈霉菌SCSIO02999中ptm基因簇進(jìn)行激活，發(fā)現(xiàn)6種新的多環(huán)四酸酯大環(huán)酰胺PTMS，其對(duì)人癌細(xì)胞株具有較強(qiáng)細(xì)胞毒活性，體內(nèi)基因破壞實(shí)驗(yàn)和體外生化實(shí)驗(yàn)表明多循環(huán)形成一個(gè)還原環(huán)化級(jí)聯(lián)，并證明PtmC是雙功能環(huán)化酶，可催化伊卡毒素內(nèi)五元環(huán)形成。

3 真菌基因組挖掘進(jìn)展

來(lái)源于真菌的天然產(chǎn)物具有廣泛的生物活性，然而其遺傳調(diào)控途徑相對(duì)細(xì)菌復(fù)雜，導(dǎo)致現(xiàn)階段對(duì)其研究較少。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)發(fā)展，對(duì)復(fù)雜微生物代謝通路進(jìn)行分析的技術(shù)逐漸成熟，真菌作為尋找新穎骨架結(jié)構(gòu)和獨(dú)特作用機(jī)制藥物的重要來(lái)源，其生物醫(yī)藥價(jià)值受到眾多科學(xué)家的關(guān)注。真菌中次級(jí)代謝產(chǎn)物主要分為：萜類(lèi)化合物、聚酮類(lèi)化合物、生物堿、非核糖體肽、氨基酸衍生物、氨基酸/聚酮雜合體細(xì)胞松弛素等。目前已從真菌中獲得的藥物包括具有抑菌、抗腫瘤、抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能的核苷酸類(lèi)抗菌素蟲(chóng)草菌素；藥用真菌靈芝中分離的抗氧化抗衰老、促進(jìn)核酸蛋白質(zhì)代謝的靈芝多糖以及最經(jīng)典的青霉素（圖2-A）和頭孢菌素（圖2-B）等，研究還發(fā)現(xiàn)紅豆杉內(nèi)生真菌會(huì)合成毒性較小的廣譜抗腫瘤藥物紫杉醇（圖2-C）［34］。絕大多數(shù)真菌種類(lèi)屬于尚未認(rèn)知狀態(tài)，近幾年對(duì)于真菌挖掘潛在藥物又有了新進(jìn)展［35］。

Shu等［36］從青霉Penicilin Herquei中分離到新的重氮雜環(huán)辛烷衍生物和新戊二酮衍生物，進(jìn)行生物活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)具有抗丙型肝炎病毒（Human antiheptitis C virus，HCV）能力，這是首次報(bào)道具有抗HCV能力的重氮環(huán)辛烷衍生物（3-A）。Chiba等［37］在篩選新的抗流感病毒時(shí)，從真菌FKI-7215發(fā)酵液中分離出草甘氨酸A（Herquline A）（圖3-C），其對(duì)于流感病毒復(fù)制有劑量依賴(lài)性的抑制作用且對(duì)病毒神經(jīng)氨酸酶沒(méi)有抑制作用。Tansakul等［38］從土壤真菌黑曲霉（Penicillium herqueiPSURSPG93）中分離出新的苯丙烯酮衍生物和五個(gè)已知的phenalenone衍生物，其一個(gè)phnalenone衍生物對(duì)非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，但抗氧化能力弱。Arunpanichlert等［39］在海草源真菌Pestalotiopsp中分離出4種新的代謝產(chǎn)物，包括2種巰基萜類(lèi)、1種異香豆素和1種苯酚，提出了一種多烯類(lèi)化合物的生物合成途徑并有較好的抗菌、抗瘧和細(xì)胞毒活性。Klaiklay等［40］從紅樹(shù)林真菌Pestalotitisp中分離到4種新的聯(lián)苯醚、3種新的色酮、1種新的黃酮、1種新的花椒酮、1種新的丁烯內(nèi)酯-Pestrolide（圖3-D）和11種已知化合物。光譜技術(shù)確定了它們的結(jié)構(gòu)。Pestalolide對(duì)白色念珠菌和新隱球菌具有較好的抗真菌活性。Uchoa等［41］通過(guò)改變培養(yǎng)條件，從巴西海岸篩選的一株黑曲霉中發(fā)現(xiàn)具有新的氮化骨架的天然呋喃衍生物（圖3-B），其對(duì)HCT-116細(xì)胞系具有毒活性。隨著研究的深入，真菌作為具有重大潛在價(jià)值的自然資源寶庫(kù)，在研究新型藥物和開(kāi)發(fā)藥物先導(dǎo)化合物過(guò)程中將發(fā)揮重要作用。

圖2 青霉素（A）、頭孢菌素C（B）、紫杉醇（C）結(jié)構(gòu)

圖 3 抗HCV（A）、抗HCT-116（B）、Herquline A（C）、Pestrolide（D）結(jié)構(gòu)

4 展望

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使人們對(duì)于生物體遺傳基因、代謝調(diào)控機(jī)制的了解愈加深刻，也越來(lái)越渴望通過(guò)基因水平定向?qū)ふ遗c實(shí)際需求相符的藥物，尤其近幾年計(jì)算機(jī)和數(shù)學(xué)等工具發(fā)展帶來(lái)的強(qiáng)大基因圖譜分析能力，更是為此提供強(qiáng)大的助力。隨著大量微生物遺傳圖譜公布，潛在的合成基因簇?cái)?shù)據(jù)不斷積累，最終對(duì)于天然活性產(chǎn)物的挖掘?qū)?huì)得到井噴式發(fā)展，具有有效藥用價(jià)值的化合物也會(huì)越來(lái)越多，真菌由于自身特性也必將扮演重要的角色。盡管現(xiàn)如今對(duì)于微生物資源利用才剛剛起步，尚沒(méi)有完善的依托基因組挖掘技術(shù)開(kāi)發(fā)藥物的流程，但可以預(yù)計(jì)，通過(guò)誘導(dǎo)激活沉默基因簇充分挖掘生物合成潛力，將成為未來(lái)新藥研發(fā)的重要手段，也會(huì)吸引更多國(guó)內(nèi)外科研工作者的興趣。