張向華,李進(jìn)英,高金生

張向華,四川南充儀隴縣人民醫(yī)院消化內(nèi)五科 四川省南充市 637600

李進(jìn)英,山東青島市中心醫(yī)院放療科 山東省青島市 266042

高金生,四川南充儀隴縣人民醫(yī)院腫瘤科 四川省南充市 637600

核心提要：膽汁淤積性肝病(cholestatic liver disease,CSLD)病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制有待深入闡明,尚缺乏足夠有效的治療手段.本研究通過檢測(cè)CSLD患者與正常人群中血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non coding RNA,LncRNA)-ATB的差異表達(dá),分析其臨床意義.研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-ATB在CSLD患者中血清中高表達(dá)； LncRNA-ATB的表達(dá)與病情及膽汁淤積的程度相關(guān),隨著膽汁淤積程度的加重血清LncRNA-ATB的表達(dá)下降,LncRNA-ATB與TBA的量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.LncRNA-ATB的表達(dá)水平有望成為判斷CSLD患者病情及預(yù)后的生物標(biāo)志物.

0 引言

膽汁淤積性肝病(cholestatic liver disease,CSLD)是臨床上常見的一大類肝病,是指由肝內(nèi)外各種原因所致的膽汁形成、分泌和(或)排泄障礙,膽汁不能正常流入十二指腸,從而反流入血產(chǎn)生的臨床病理狀態(tài),臨床可出現(xiàn)乏力、瘙癢、尿色加深和黃疸等表現(xiàn)[1-3].其主要的發(fā)病機(jī)制為在各種致肝損傷因素作用下,肝臟內(nèi)大量炎性因子浸潤(rùn)及氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致肝臟功能損傷[4,5].治療上及時(shí)控制病因和通過藥物治療緩解或阻斷膽汁淤積及相關(guān)病變是絕大多數(shù)CSLD患者的主要治療手段.熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的可用于原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)治療的唯一有效藥物[6],但由于發(fā)病機(jī)制和疾病階段的不同,目前臨床治療中對(duì)UDCA應(yīng)答不佳的患者逐漸增多.因此,探索CSLD發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制,尋找CSLD診治的生物標(biāo)志物,對(duì)于改善預(yù)后及提高生存具有十分重要的意義.

近年來的研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non coding RNA,LncRNA)的異常調(diào)控與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).近年來的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA參與調(diào)節(jié)膽汁酸信號(hào)和膽汁淤積性肝纖維化的發(fā)生[7].Xiao等[8]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA h19與膽道閉鎖患者膽管細(xì)胞增殖和膽汁淤積性肝纖維化的發(fā)生相關(guān).還有研究提出轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)β激活的LncRNA(LncRNA-activated by TGFβ,LncRNA-ATB)表達(dá)增加與肝硬化呈正相關(guān)[9,10].LncRNA-ATB是位于人第14號(hào)染色體,長(zhǎng)度約80 kb的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,主要參與肝細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種消化道惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[11-14].目前關(guān)于LncRNA-ATB在CSLD中的作用及潛在的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚.本研究通過檢測(cè)LncRNA-ATB在CSLD患者血清中的表達(dá)情況,分析血清LncRNA-ATB表達(dá)與CSLD的相關(guān)性,判斷血清LncRNA-ATB對(duì)CSLD的診斷價(jià)值,為臨床診斷CSLD提供新的生物學(xué)標(biāo)記.

1 材料和方法

1.1 材料 收集2017-01/2018-12就診于我院消化科的肝內(nèi)CSLD患者75例,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)10例,自身免疫性肝病(autoimmune liver disease,AIH)10例,PBC 20例,藥物性肝損傷(druginduced liver injury,DILI)10例,酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)12例,其他不明原因者13例.同時(shí)于我院檢驗(yàn)科行肝功能相關(guān)的生化指標(biāo)如丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT),天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST),堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(gamma-glutamyltransferase,GGT),總膽紅素(total bilirubin,TBIL),直接膽紅素(direct bilirubin,DBIL)及總膽汁酸(total bile acid,TBA)等指標(biāo)檢測(cè).所有患者均符合2009年歐洲肝病學(xué)會(huì)“膽汁淤積性肝病處理臨床實(shí)踐指南”及2015年我國(guó)發(fā)布的“膽汁淤積性肝病診斷與治療共識(shí)”中推薦的膽汁淤積診斷標(biāo)準(zhǔn)[15]：ALP超過正常上限的1.5倍且GGT超過正常上限3倍,然后可根據(jù)臨床、生物化學(xué)、病毒血清學(xué)、免疫檢測(cè)、影像學(xué)(超聲、CT及MRI)和肝組織病理學(xué)檢查排除肝外梗阻性疾病.所有研究對(duì)象診斷明確后次日清晨空腹采集靜脈血5 mL,靜置2-4 h后進(jìn)行離心,轉(zhuǎn)速2500-3000 r/min,時(shí)間為10 min； 將離心獲得的血清分裝后用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè).本研究通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批件編號(hào)：2016-009),并且所有研究對(duì)象均簽署知情同意書.

1.2 方法 Real-time PCR分析LncRNA-ATB的表達(dá)水平：采用TRIZOL(Invitrogen,Grand Island,NY)方法提取血清標(biāo)本中總RNA.將提取的總RNA,參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的方法將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA.采用2×SYBR Green PCR Master Mix,以cDNA為摸板,進(jìn)行qRT-PCR.PCR反應(yīng)在定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行.三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.LncRNA-ATB在血清標(biāo)本中的差異表達(dá)采用t檢驗(yàn)分析.LncRNA-ATB與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square檢驗(yàn)； 采用person相關(guān)分析LncRNA-ATB的表達(dá)與臨床各指標(biāo)的關(guān)系,受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic,ROC)分析LncRNA-ATB的臨床意義及預(yù)測(cè)價(jià)值.

2 結(jié)果

2.1 CSLD患者血清中LncRNA-ATB的表達(dá) 與健康對(duì)照組(1.473±0.105)比較,LncRNA-ATB在CSLD患者(8.823±0.316)中的表達(dá)顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.52,P＜0.001)(圖1).

2.2 不同病因及病程CSLD患者血清中LncRNA-ATB的差異表達(dá) LncRNA-ATB的表達(dá)水平在不同病因疾病之間的差異無顯著差異(P＞0.05)(圖2A)； LncRNA-ATB在6 mo以內(nèi)的CSLD患者與6 mo以上患者之間的表達(dá)差異無明顯差異(P＞0.05)(圖2B).

2.3 LncRNA-ATB在不同程度CSLD患者中的表達(dá) 研究顯示,LncRNA-ATB在輕、中、重度肝內(nèi)CSLD患者血清中的表達(dá)均明顯高于健康對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)； LncRNA-ATB在中、重度CSLD患者血清中的表達(dá)較輕度CSLD患者降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001),但中、重度CSLD患者血清LncRNAATB的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖3).

2.4 LncRNA-ATB與總膽汁酸的相關(guān)性 CSLD的形成與膽汁的合成、分泌相關(guān),TBA是反映膽汁淤積程度的最直接指標(biāo).進(jìn)一步分析LncRNA-ATB與TBA的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),LncRNA-ATB與TBA的量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.627,P＜0.001)(圖4).

2.5 LncRNA-ATB的水平對(duì)CSLD患者疾病的診斷價(jià)值我們擬通過ROC曲線來分析LncRNA-ATB水平變化對(duì)CSLD的疾病診斷價(jià)值.LncRNA-ATB診斷CSLD的曲線下面積為0.856,診斷的敏感性為81.42%,特異性則為73.45%(95%CI 0.809-0.904,P＜0.001)(圖5).

圖1 LncRNA-ATB在膽汁淤積組與健康對(duì)照組血清中的差異表達(dá).CSLD：膽汁淤積性肝病.

圖2 不同的CSLD患者血清中LncRNA-ATB的差異表達(dá).A：不同病因?qū)е碌腃SLD患者； B：不同病程的CSLD患者.CHB：慢性乙型肝炎； AIH：自身免疫性肝??； PBC：原發(fā)性膽汁性膽管炎； DILI：藥物性肝損傷； ALD：酒精性肝病； other：其他； CSLD：膽汁淤積性肝病.

圖3 LncRNA-ATB在不同程度膽汁淤積患者中的表達(dá).Normal：正常； Mild：輕度； Moderate：中度； Severe：重度.

圖4 LncRNA-ATB與總膽汁酸的相關(guān)性.TAB：膽汁酸.

3 討論

CSLD是指能夠引起膽汁淤積的多種肝病的集合和統(tǒng)稱[16],其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,多種導(dǎo)致肝損傷因素均可引起膽汁淤積,長(zhǎng)期膽汁淤積又是肝病持續(xù)進(jìn)展的重要因素[17].隨著對(duì)膽汁淤積癥病理生理現(xiàn)象的認(rèn)識(shí),在該領(lǐng)域的研究也越來越深入[18].但其發(fā)病機(jī)制有待深入闡明,尚缺乏足夠有效的治療手段.

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt的不具備編碼蛋白功能的RNA分子,可在表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個(gè)層面調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)[19].近年研究表明,LncRNAs差異表達(dá)或功能失調(diào)參與多種疾病的發(fā)生及進(jìn)展,其與肝細(xì)胞再生、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)以及肝癌的發(fā)生等密切相關(guān)[20]； 此外,LncRNAs還可以參與調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞功能,影響肝纖維化的發(fā)病與進(jìn)展[21].目前關(guān)于LncRNAs在CSLD方面的研究不多,研究發(fā)現(xiàn)LncRNA H19通過阻止ZEB1介導(dǎo)的上皮細(xì)胞粘附分子抑制促進(jìn)膽汁淤積性肝纖維化[22].H19/miR-148a/USP4軸通過增強(qiáng)肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞的TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)肝纖維化[23].LncRNA MEG3通過與PTBP1相互作用促進(jìn)shp mRNA衰變,誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷.然而,關(guān)于LncRNA-ATB在CSLD患者中的表達(dá)及意義目前國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道.課題組前期通過基因芯片在CSLD患者與正常人之間的差異表的LncRNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA-ATB在CSLD患者血清中的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯顯著增加,但是LncRNA-ATB在CSLD患者中的作用及分子機(jī)制尚不清楚.LncRNA-ATB被證實(shí)參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移,并與肝硬化呈正相關(guān)[20,21].我們研究發(fā)現(xiàn),LncRNA-ATB在CSLD患者血清中的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加,LncRNA-ATB的表達(dá)水平在不同病因疾病及不同病程的CSLD患者之間的表達(dá)差異無明顯差異.血清LncRNA-ATB隨著膽汁淤積程度的加重而下降,LncRNA-ATB與TBA的量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,LncRNA-ATB診斷CSLD的曲線下面積為0.856,診斷的敏感性為81.42%,特異性則為73.45%.以上研究結(jié)果提示LncRNA-ATB可能成為CSLD病情程度及動(dòng)態(tài)變化轉(zhuǎn)歸較為敏感的預(yù)測(cè)指標(biāo).

圖5 LncRNA-ATB的水平對(duì)膽汁淤積性肝病患者疾病的診斷價(jià)值.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

膽汁淤積性肝病(cholestatic liver disease,CSLD)病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制有待深入闡明,尚缺乏足夠有效的治療手段.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

進(jìn)一步明確CSLD的分子機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

檢測(cè)CSLD患者與正常人群中血清LncRNA-ATB的差異表達(dá),分析其臨床意義.

實(shí)驗(yàn)方法

Real-time PCR分析LncRNA-ATB的表達(dá)水平.采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.LncRNA-ATB在血清標(biāo)本中的差異表達(dá)采用t檢驗(yàn)分析.LncRNA-ATB與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square檢驗(yàn)； 采用person相關(guān)分析LncRNA-ATB的表達(dá)與臨床各指標(biāo)的關(guān)系,受試者工作特征曲線分析LncRNA-ATB的臨床意義及預(yù)測(cè)價(jià)值.

2007年，中國(guó)空間技術(shù)研究院袁俊剛等[34]首次運(yùn)用量綱理論，將結(jié)合超高速撞擊實(shí)驗(yàn)及數(shù)值仿真數(shù)據(jù)，建立了Whipple防護(hù)結(jié)構(gòu)撞擊極限方程。由于在量綱理論建模過程中，大量的待定系數(shù)直接引用NASA方程系數(shù)，因此其方程精度與最新NASA/JSC方程精度近似。該方程適用于緩沖屏為鋁合金材料，彈丸為純鋁及鋁合金材料，彈丸直徑d=0.04～1.27 cm，碰撞速度v=1.6～11 km·s-1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與健康對(duì)照組比較,LncRNA-ATB在CSLD患者中血清中明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).LncRNAATB的表達(dá)水平在不同病因?qū)е碌腃SLD及不同病程的CSLD患者之間的表達(dá)無明顯差異(P＞0.05).血清LncRNA-ATB隨著膽汁淤積程度的加重而下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)； LncRNA-ATB與TBA的量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.627,P＜0.001),LncRNA-ATB診斷CSLD的曲線下面積為0.856,敏感性為81.42%,特異性則為73.45%(95%CI：0.809-0.904,P＜0.001).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

LncRNA-ATB在肝內(nèi)CSLD患者血清中的含量明顯升高,隨著膽汁淤積程度的加重而下降.

展望前景

LncRNA-ATB的表達(dá)水平有望成為判斷CSLD患者病情及預(yù)后的生物標(biāo)志物質(zhì).