缺血預(yù)適應(yīng)聯(lián)合硒/丹參酮ⅡA對大鼠子宮再灌注損傷的影響

張爽 王冬

【摘要】 目的 研究缺血預(yù)適應(yīng)聯(lián)合硒/丹參酮ⅡA對大鼠子宮再灌注損傷的影響。方法 清潔級Wistar大鼠64只， 隨機分為A組（模型組）、B組（預(yù)適應(yīng)組）、C組（預(yù)適應(yīng)+硒組）、D組（預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組）， 每組16只。四組大鼠均采用線栓法制備缺血再灌注損傷模型， 預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組在造模前2 h、1 h和30 min各進行3個循環(huán)的缺血15 s+再灌注30 s。預(yù)適應(yīng)+硒組在術(shù)前7 d起給予飲水中加入硒酵母片2～4 μg/（kg·d）， 預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組于術(shù)前7、5、3、1 d給予腹腔注射丹參酮ⅡA注射液20 mg/kg。缺血再灌注2 h取大鼠子宮組織， 利用分光光度計測量大鼠子宮組織勻漿中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）值， 免疫組化染色法（SABC）檢測B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）蛋白表達， 并進一步行Western blot。結(jié)果 預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中MDA、 SOD水平均低于模型組， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;預(yù)適應(yīng)組與預(yù)適應(yīng)+硒組大鼠子宮組織中MDA、 SOD水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組大鼠子宮組織中MDA水平均高于預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組， SOD水平均低于預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達水平分別為（25.7±3.9）、（26.4±3.7）、（29.9±4.2）， 均高于模型組的（17.2±2.5）， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;預(yù)適應(yīng)組與預(yù)適應(yīng)+硒組的大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達水平高于預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 缺血預(yù)適應(yīng)、缺血預(yù)適應(yīng)聯(lián)合硒/丹參酮ⅡA對大鼠子宮缺血再灌注損傷具有保護作用， 且缺血預(yù)適+丹參酮ⅡA對其保護作用明顯提高。

【關(guān)鍵詞】 缺血預(yù)適應(yīng);缺血再灌注損傷;丹參酮ⅡA;硒;子宮組織;大鼠

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.28.112

【Abstract】 Objective? ?To study the effect of ischemic preconditioning combined with selenium/tanshinone ⅡA on uterine reperfusion injury in rats. Methods? ?A total of 64 clean Wistar rats were randomly divided into group A （model group）， group B （preconditioning group）， group C （preconditioning + selenium group）， and group D （preconditioning + tanshinone ⅡA group）， with 16 rats in each group. The models of ischemia-reperfusion injury were prepared by suture method in four groups of rats. The preconditioning group， preconditioning + selenium group， preconditioning + tanshinone ⅡA group were performed for 3 cycles of ischemia 15 s+ reperfusion 30 s at 2 h，?1 h and 30 min before modeling. Preconditioning + selenium group was given 2～4 μg/（kg·d） of selenium yeast tablets in drinking water at 7 d before operation， and the preconditioning + tanshinone ⅡA group was given intraperitoneal injection of tanshinone ⅡA injection 20 mg/kg at 7， 5， 3 and 1 d before operation. Uterine tissue was taken from rats after 2 h of ischemia-reperfusion. The values of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） in rat uterine homogenate were measured by spectrophotometer， and the expression of Bcl-2 gene was detected by immunohistochemical staining （SABC） and further by Western blot. Results? ?The levels of MDA and SOD of uterine tissue in preconditioning group， preconditioning + selenium group， preconditioning + tanshinone ⅡA group were lower that those in model group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in levels of MDA and SOD of uterine tissue in preconditioning group and preconditioning + selenium group （P>0.05）. The MDA level of uterine tissue in preconditioning group and preconditioning + selenium group was higher than that in preconditioning + tanshinone ⅡA group， and SOD level was lower than that in preconditioning + tanshinone ⅡA group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. The expression level of Bcl-2 of uterine tissue in preconditioning group， preconditioning + selenium group， preconditioning + tanshinone ⅡA group were （25.7±3.9）， （26.4±3.7） and （29.9±4.2） respectively， and those were all higher than （17.2±2.5） in model group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. There was no statistically significant difference in expression level of Bcl-2 of uterine tissue between preconditioning group and preconditioning + selenium group （P>0.05）. The expression level of Bcl-2 of uterine tissue in preconditioning + selenium group was higher than those in preconditioning group and preconditioning + selenium group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? ?Ischemic preconditioning and ischemic preconditioning combined with selenium/tanshinone ⅡA have protective effects on uterine ischemia-reperfusion injury in rats， and the protective effect of ischemic preconditioning + tanshinone ⅡA is obviously improved.

【Key words】 Ischemic preconditioning; Ischemia-reperfusion injury; Tanshinone ⅡA; Selenium; Uterine tissue; Rats

缺血再灌注損傷主要是指恢復(fù)缺血組織的血流灌注對組織造成的嚴重損傷， 而缺血預(yù)適應(yīng)主要是指短暫缺血再灌可增強組織對隨后較長時間缺血損傷耐受性的現(xiàn)象。國內(nèi)外關(guān)于缺血再灌注損傷及缺血預(yù)適應(yīng)的研究主要集中于心、腦、腎等重要組織器官[1， 2]。子宮是人體重要的生殖器官， 缺血再灌注損傷影響生殖功能。本課題組前期工作已完成子宮缺血再灌注損傷模型[3]， 并證實了中藥丹參酮ⅡA[4]對子宮缺血再灌注損傷具有保護作用。本研究通過實驗證實缺血預(yù)適、缺血預(yù)適應(yīng)聯(lián)合硒/丹參酮ⅡA對大鼠子宮缺血再灌注損傷具有保護作用， 且缺血預(yù)適+丹參酮ⅡA對其保護作用明顯提高， 對臨床工作提供實驗室依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料 選用清潔級8周齡Wistar雌性大鼠64只， 體重178～246 g， 由吉林大學(xué)實驗動物中心提供， 許可證號：SCXK（吉）2008-0005。隨機分為模型組、預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組， 每組16只。

1. 2 儀器和試劑 TD5A型凱達離心機（湖南凱達科學(xué)儀器有限公司）， 電子精密天平（上海精密儀器儀表有限公司）， UV-755B型紫外可見分光光度計（上海巴玖實業(yè)有限公司）， 顯微鏡（上海醫(yī)療器械七廠）。BCl-2原位雜交檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）， MDA測定試劑盒（北京雷根生物科技有限公司）， SOD活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。硒酵母片（牡丹江靈泰藥業(yè)股份有限公司）， 丹參酮ⅡA（上海第一生化藥業(yè)有限公司）。

1. 3 模型的制備 采用線栓法制備缺血再灌注損傷模型。各組大鼠造模前6 h禁食， 室溫20～ 25℃， 用體積分數(shù)10%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠， 視大鼠角膜反射、是否有肌肉顫動等情況， 將大鼠維持一定的麻醉深度， 成功后， 將其仰臥固定， 于下腹部正中做一縱形切口， 長（5±1） cm， 并以切口下端為中點， 向兩側(cè)各延長1 cm， 形成一“⊥”形切口， 以便充分暴露大鼠子宮及鄰近臟器， 將兩側(cè)腹壁組織外翻， 4-0絲線縫扎固定， 以避免遮擋視野， 增加手術(shù)時間， 用濕潤棉簽和眼科鑷輕柔向上推離大鼠腸管， 暴露大鼠子宮， 大隱靜脈注射50 U/kg肝素5 min后， 應(yīng)用玻璃分針鈍性分離大鼠腹腔動脈， 注意辨明髂腰動、靜脈， 避免損傷致大出血， 在髂總動脈分叉處上方0.5 cm處用4-0絲線以方結(jié)結(jié)扎腹腔動脈， 剪斷下腹壁兩側(cè)固定縫扎線， 以減少大鼠腹腔臟器水分的流失， 30 min后去除結(jié)扎線， 形成再灌注[3]。

1. 4 實驗方法 除模型組外， 預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組在造模前2 h、1 h、30 min各行3個循環(huán)的缺血15 s+ 再灌注30 s）。預(yù)適應(yīng)+硒組在術(shù)前7 d起給予飲水中加入硒酵母片2～4 μg/（kg·d）， 預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組于術(shù)前7、5、3、1 d給予腹腔注射丹參酮ⅡA注射液20 mg/kg。采用線栓法建立大鼠子宮缺血再灌注損傷模型。再灌注2 h取大鼠子宮組織， 將子宮組織在冰冷生理鹽水中漂洗干凈， 除去血液， 濾紙拭干， 稱質(zhì)量后加入4℃的HEPES緩沖液中， 其體積是子宮組織塊質(zhì)量的9倍， 用玻璃勻漿器制成勻漿， 勻漿液以3000 r/min離心15 min， 取上清液， 70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明書， 利用分光光度計檢測大鼠子宮組織的SOD、MDA水平。取大鼠子宮組織， 入4%多聚甲醛固定24 h， 常規(guī)石蠟包埋、脫水、切片， 厚5 μm， 小鼠抗大鼠Bcl-2單克隆抗體活性檢測試劑， 參照免疫組化試劑盒說明書， 嚴格按照試劑盒操作步驟行免疫組織化學(xué)染色， 以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）代替一抗作陰性對照， DAB顯色， 鏡下觀察顯色， 蘇木精輕度復(fù)染， 梯度脫水， 透明中性樹膠封片。陽性判斷：Bcl-2陽性為胞質(zhì)及胞膜內(nèi)側(cè)出現(xiàn)黃至棕黃色顆粒， 每只大鼠取4張切片染色， 每張切片隨機取5個高倍鏡視野（×400）， 計數(shù)每個高倍鏡視野內(nèi)的陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)， 求其平均值， 并取大鼠子宮組織的勻漿樣本進行 Western blot。目的蛋白的I抗稀釋度為1︰400， 抗GAPDH的I抗稀釋度為1︰6000， 4 ℃過夜。Ⅱ抗[山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）， 稀釋度為1：2000]室溫振蕩孵育2 h， 洗滌后顯影。采用 Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)對各條帶的總灰度值作相對定量比較。

1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組大鼠子宮組織中MDA、SOD水平比較 預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中MDA、 SOD水平均低于模型組， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;預(yù)適應(yīng)組與預(yù)適應(yīng)+硒組大鼠子宮組織中MDA、 SOD水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組大鼠子宮組織中MDA水平均高于預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組， SOD水平均低于預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 各組大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達水平比較 預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組、預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達水平分別為（25.7±3.9）、（26.4±3.7）、（29.9±4.2）， 均高于模型組的（17.2±2.5）， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;預(yù)適應(yīng)組與預(yù)適應(yīng)+硒組的大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;預(yù)適應(yīng)+丹參酮ⅡA組大鼠子宮組織中Bcl-2蛋白表達水平高于預(yù)適應(yīng)組、預(yù)適應(yīng)+硒組， 差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。其Western blot檢測結(jié)果見圖1。