陳舒穎 廖明 楊麗娜

【摘要】 目的 探討TET1蛋白對乳腺癌細胞株MDA-MB-453增殖的影響。方法 將TET1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株（MDA-MB-453-TET1）和其陰性對照組穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株（MDA-MB-453-NC）通過慢病毒載體構(gòu)建出來， 采用RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）-聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）及蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法檢測TET1的表達情況。細胞增殖實驗（CCK-8法）檢測細胞增殖;Western blot檢測上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白[上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-鏈蛋白（β-catenin）]的呈現(xiàn)。結(jié)果 陰性對照組與空白對照組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、TET1 mRNA及TET1表達水平比較， 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1組E-cadherin（2.98±0.11）、TET1 mRNA（5.36±0.02）及TET1（12.3±0.41）均顯著高于陰性對照組的（0.98±0.21）、（1.25±0.08）、（4.21±0.09）與空白對照組的（0.95±0.2）、（1.23±0.04）、（4.19±0.10）， N-cadherin（0.08±0.02）、Vimentin（4.41±0.18）、β-catenin（0.05±0.002）均低于陰性對照組的（0.10±0.01）、（9.98±0.52）、（0.11±0.02）與空白對照組的（0.11±0.02）、（9.97±0.45）、（1.23±0.04）， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。陰性對照組與空白對照組OD值比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1組OD值低于陰性對照組與空白對照組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 TET1可抑制MDA-MB-453細胞增殖， 其機制可能與通過Wnt/β-catenin通路抑制EMT的發(fā)生相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌;細胞株MDA-MB-453;TET1蛋白;細胞增殖

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.28.113

TET蛋白是存在于生物體內(nèi)的一種雙加氧酶， 其不但能使5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥甲基胞嘧啶， 同時還是DNA去甲基化過程中必不可少的一種酶， 這種酶在保持干細胞的多能性時也有著相當重要的用處[1]。該家族主要包括3種蛋白酶， 即TET1、TET2和TET3， 其中TET1蛋白參與腫瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過程[2]。通過體外實驗研究TET1對乳腺癌細胞增殖能力的影響， 為研究乳腺癌的發(fā)生提供一定的參考。

1 材料與方法

1. 1 試劑 人乳腺癌細胞株MDA-MB-453與人胚腎HEK 293T慢病毒包裝細胞（深圳市百恩維生物科技有限公司提供）;DMEM培養(yǎng)液（武漢普諾賽生命科技有限公司提供）;胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司提供）;Ⅱ型膠原酶（上海玉博生物科技有限公司提供）;胰蛋白酶及基質(zhì)膠與Mdivi-1（上海玉博生物科技有限公司提供）;兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin一抗、羊抗兔熒光二抗、羊抗鼠熒光二抗均購自美國Sigma公司。

1. 2 方法 根據(jù)慢病毒的包裝試劑外殼的使用說明來操作， 把轉(zhuǎn)染的293T細胞培育72 h， 然后將培育中的清液收集起來， 即是慢病毒液。然后把感染靶細胞（MDA-MB-453）用嘌呤霉素做一次詳細的挑選， 從中取得MDA-MB-453-TET1組和陰性對照組（MDA-MB-453-NC）;最后用未感染的細胞作為空白對照組。三組分別選取2×106個細胞進行分析， 對三組細胞進行增殖實驗。

按照TET1試劑盒說明書進行操作。制備電泳膠， 將電泳膠放入電泳槽， 在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）熱循環(huán)儀中將其逆轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA）。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參， 上游5'-GAAGTCACCCGCGTGCTAAT-3'， 下游5'-TCACTGCTCCCGAATGTCT-3';TET1上游5'-GTGTGATGAGCCCAAGGA-3'， 下游5'-GCAGTTGGCTCGCATCATAG-3'。PCR反應(yīng)條件：在95℃10 min， 95℃50 s， 52℃50 s， 72℃3 min， 重復(fù)37個循環(huán)， 72℃延伸反應(yīng)20 min， 計算TET1信使RNA（mRNA）水平相對表達量。

提取細胞總蛋白， 然后作十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）， 再轉(zhuǎn)膜， 在其中添加對應(yīng)一抗， 以4℃的溫度放置一晚。第2天進行含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）漂洗， 加入二抗， 室溫孵育2 h， 增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色， 計算蛋白水平的相對表達量。

將對數(shù)生長期細胞， 按1×103個細胞的量加入到96孔板里面， 放入CCK-8后進行細胞培養(yǎng)， 時間的設(shè)定為0、12、24、36和72 h， 根據(jù)時間長短的排序依次放入CCK-8試劑10 μl/孔， 37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng);酶標儀上檢測各孔450 nm處的光密度（OD）值。這一實驗過程最少要進行3次以上， 然后根據(jù)實驗結(jié)果對實驗數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學(xué)分析和研究。

1. 3 觀察指標 比較三組RT-PCR及Western blot法檢測結(jié)果以及細胞增殖能力檢測結(jié)果。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所獲數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布規(guī)律， 計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 三組RT-PCR及Western blot法檢測結(jié)果比較 陰性對照組與空白對照組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、TET1 mRNA及TET1表達水平比較， 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1組E-cadherin、TET1 mRNA及TET1表達水平均顯著高于陰性對照組與空白對照組， N-cadherin、Vimentin、β-catenin表達水平均低于陰性對照組與空白對照組， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 三組細胞增殖能力檢測結(jié)果比較 陰性對照組與空白對照組OD值比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。MDA-MB-453-TET1組OD值低于陰性對照組與空白對照組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

研究表明[3]， TET1可以調(diào)控DNA去甲基化， 參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT可導(dǎo)致腫瘤細胞離開原發(fā)部位， 經(jīng)過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)移動到其他地方。在這個過程中， 腫瘤細胞得到了間質(zhì)細胞才有的遷徙能力， 這是由于腫瘤細胞的上皮型標志物E-cadherin的表達呈下降趨勢， 間質(zhì)型標志物Vimentin和N-cadherin的表達呈上升狀態(tài)而導(dǎo)致的。大量研究表明， E-cadherin的啟動子區(qū)域有超甲基化這一現(xiàn)象， 這也被視作是引起E-cadherin表達呈下降趨勢的一大主要影響因素。TET1經(jīng)過調(diào)整EMT相關(guān)蛋白的表達來影響乳腺癌的侵襲和移動[4-6]。

本研究中TET1在MDA-MB-453-TET1組出現(xiàn)高表達， 陰性對照組與空白對照組出現(xiàn)低表達， 說明MDA-MB-453-TET1的構(gòu)建比較成功。MDA-MB-453-TET1細胞中E-cadherin表現(xiàn)是一種高表達， N-cadherin、Vimentin、β-catenin表現(xiàn)是一種低表達。實驗表明， TET1能經(jīng)過調(diào)節(jié)EMT影響乳腺癌的侵襲和移動， 然后經(jīng)過推進乳腺癌細胞向上皮樣表型轉(zhuǎn)化， 提高E-cadherin的表達增強細胞間的黏附能力， 最終使N-cadherin、Vimentin和β-catenin減少， 從而抑制EMT發(fā)生。CCK-8法進行檢測乳腺癌細胞株增殖能力實驗中， 在接種細胞24、36、72 h后MDA-MB-453-TET1組的細胞生長速度明顯減慢。說明TET1的過表達抑制乳腺癌MDA-MB-453細胞的增殖。

綜上所述， TET1可抑制MDA-MB-453細胞增殖， 其機制可能與通過EMT相關(guān)蛋白通路抑制EMT的發(fā)生相關(guān)。

參考文獻

[1] 段紅潔， 張愛民， 牛秀瓏， 等. IFN-γ和IL-4對人乳腺癌細胞系MCF-7成瘤性、黏附能力的影響及其機制. 中國腫瘤生物治療雜志， 2015， 22（5）：597-602.

[2] Chen HF， Wu KJ. Epigenetics， TET proteins， and hypoxia in epithelial-mesenchymal transition and tumorigenesis. BioMedicine（Taipei）， 2016， 6（1）：1-8.

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[4] 張萌萌， 李雅琪， 張碩， 等. TET1蛋白對人乳腺癌MDA-MB-231細胞株增殖和侵襲能力的影響及其相關(guān)機制. 腫瘤防治研究， 2017， 44（7）：447-453.

[5] Jeschke J， Collignon E， Fuks F. Portraits of TET-mediated DNA hydroxymethylation in cancer. Curr Opin Genet Dev， 2016， 36（36）：16-26.

[6] Yang H， Liu Y， Bai F， et al. Tumor development is associated with decrease of TET gene expression and 5-methylcytosine hydroxylation. Oncogene， 2013， 32（5）：663-669.

[收稿日期：2019-03-06]