陳 恩，蔡 煒，吳佳易，鄭行春

心肌肥厚(cardiachypertrophy，CH)是心肌細(xì)胞對(duì)心臟長期超負(fù)荷工作的的代償過程，在維持心臟功能上有著重要作用，臨床上常發(fā)生于高血壓病、急性心肌梗死后及心肌病的患者。但是，隨著疾病的進(jìn)展，心臟負(fù)荷的持續(xù)存在或增加，CH在晚期將不可避免的走向失代償，最終導(dǎo)致心力衰竭而死亡[1-2]。目前CH的病因尚未完全明確，同時(shí)臨床也缺乏切實(shí)有效的治療策略。因此，尋找新的有效的治療靶點(diǎn)一直是研究的熱點(diǎn)，近年的研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)參與調(diào)控CH，與心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)[3-6]。miRNA是一種大小為19～25個(gè)堿基的單鏈非編碼小分子RNA，通過其“種子序列”與靶mRNA 3′-端非翻譯區(qū)(UTR)的序列完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA 降解或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[7-8]。有研究報(bào)道，心臟特異性的miR-208a過度表達(dá)將造成小鼠心肌β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MCH)表達(dá)的增加，導(dǎo)致CH[9]；而且通過抑制小鼠miR-208a的表達(dá)，可以減少小鼠CH，從而改善心臟功能[10]。提示miR-208a有望作為逆轉(zhuǎn)CH的治療靶點(diǎn)。但是miR-208a在CH過程中的具體作用機(jī)制仍未完全明確。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-208a在HEK293細(xì)胞中能夠在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控p21的表達(dá)[11]。p21是一種重要的細(xì)胞周期抑制因子，能夠與cyclin D/CDK形成復(fù)合物使細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖，使其退出細(xì)胞周期[12]。哺乳動(dòng)物出生后不久，在正負(fù)細(xì)胞周期調(diào)控因子的共同作用下心肌細(xì)胞退出了細(xì)胞周期，大部分停滯于G0/G1期，成為高度分化的終末細(xì)胞，喪失了有絲分裂的能力[13]。即使在某些病理刺激下，心肌細(xì)胞可以通過下調(diào)p21等細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)，重返細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)合成增加[14-16]，但是，由于其喪失有絲分裂的能力，最終表現(xiàn)的是心肌細(xì)胞體積上增大(即CH)，而并非數(shù)量上的增加[17]。因此，miR-208a可能通過調(diào)控細(xì)胞周期抑制因子p21的表達(dá)，影響心肌細(xì)胞周期，從而影響CH的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究將通過建立小鼠CH模型，明確miR-208a和p21的表達(dá)情況；通過體外細(xì)胞模型，明確miR-208a影響小鼠CH的調(diào)控靶基因，為CH的基因治療提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1主要材料 8～10周齡的雄性C57BL/6L小鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)有限公司，許可證SCXK(滬)2007-00005]；小鼠心肌細(xì)胞株(HL-1)、HEK293T購至中科院上海細(xì)胞所；慢病毒載體系統(tǒng)pWPXL，psPAX2，pDM2G(上海腫瘤研究所黃勝林博士贈(zèng)送)。胚胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；miR-208a模擬物和抑制物(廣州市銳博生物科技有限公司)；定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)；Dual-Luciferase Reporter Assay System(美國Promega公司)，SuperSignal Western-blot化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)(美國Pierce公司)，p21單克隆抗體及GADPH(美國Sigma公司),山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)等。

1.2小鼠CH模型 55只清潔級(jí)小鼠，體質(zhì)量(20±5)g，分為假手術(shù)組(Sham組,n=20)和CH組(n=35)。(1)CH組：將經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉的小鼠仰臥位固定，氣管插管接呼吸機(jī)控制呼吸，胸前正中區(qū)備皮、消毒，切開皮膚，分離組織，暴露主動(dòng)脈弓，26～27 G墊扎針頭墊扎，對(duì)主動(dòng)脈及墊扎針用5號(hào)絲線結(jié)扎，結(jié)扎確實(shí)后抽出墊扎針，檢查主動(dòng)脈弓近心端波動(dòng)增強(qiáng)，逐層關(guān)胸，縫皮。手術(shù)切口處用紅霉素眼膏涂敷，待小鼠自主呼吸恢復(fù)后脫機(jī)拔管，觀察至蘇醒。(2)Sham組同期開胸但不進(jìn)行主動(dòng)脈弓結(jié)扎。(3)4周后再次麻醉小鼠，開胸取心臟，一部分做成蠟塊用于石蠟切片，另一部分保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)的RT-qPCR和Western-blot檢測(cè)。所有的小鼠試驗(yàn)均遵守相關(guān)的操作指南[18]。

1.3H-E染色 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，依次梯度乙醇水化；蘇木精液染色5 min后，流水沖洗1～3 min；然后加1%鹽酸乙醇2 s，流水沖洗3～5 min，伊紅染液復(fù)染30 s后脫水，最后用中性樹膠封片。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠心肌細(xì)胞株(HL-1)和HEK293T細(xì)胞放置于含10%胎牛血清、50 μg/mL鏈霉素和50 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為體積分?jǐn)?shù)為0.05、37 ℃的CO2飽和濕度。

1.5慢病毒載體構(gòu)建、包裝和滴度測(cè)定 根據(jù)miR-208a的基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)，以小鼠基因組DNA為模板，采用巢式PCR擴(kuò)增獲得包含pre-miR-208a序列在內(nèi)的基因序列，凝膠電泳分離目的片段，膠回收片段，酶切，純化，連接入pWPXL慢病毒載體上，構(gòu)建pWPXL-miR-208a。酶切、測(cè)序鑒定。采用脂質(zhì)體法(脂質(zhì)體2000試劑，轉(zhuǎn)染效率85%以上)按一定比例將pWPXL,pLVTHM，pWPXL-miR-208a與包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMDG2共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，要求轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為60%，包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒，連續(xù)稀釋法測(cè)定病毒滴度。測(cè)定后病毒顆粒感染心肌細(xì)胞，而后根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷感染效果。

表1 RT-PCR的引物序列

WT:野生型;M86:突變型.

1.6野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建及活性檢測(cè) (1)野生型熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建：采用PCR 分別擴(kuò)增p21基因全長的3′-UTR，凝膠電泳分離目的片段，膠回收片段，酶切，純化，連接到熒光素酶報(bào)告載體pCDNA-luciferase-MCS，構(gòu)建pCDNA-luciferase-p21。酶切、測(cè)序鑒定。(2)突變型熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建：分析miR-208a 對(duì)p21基因全長3′-UTR 的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物突變這個(gè)位點(diǎn)(表1)。采用搭橋PCR 擴(kuò)增特異片段，凝膠電泳分離目的片段，膠回收片段，酶切，連接到熒光素酶報(bào)告載體pCDNA-luciferase-MCS，構(gòu)建pCDNA-luciferase-p21-mut。酶切、測(cè)序鑒定。(3)雙熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：將pCDNA-luciferase-p21及miR-208a模擬物與對(duì)照載體及陰性對(duì)照與熒光素酶報(bào)告載體(野生型或突變型)、Renilla 共感染小鼠心肌細(xì)胞，雙熒光素酶檢測(cè)試劑檢測(cè)熒光素酶活性，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷感染效果。

1.7總RNA 提取和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-208a和p21-mRNA水平表達(dá) 總RNA提取參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書反轉(zhuǎn)錄。以GAPDH為內(nèi)參，使用qPCR試劑盒及特異性引物通過PCR儀擴(kuò)增檢測(cè)合成的cDNA,采用2-△△Ct方法，計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

Real-time PCR 對(duì)小鼠心肌細(xì)胞株進(jìn)行miR-208a的表達(dá)檢測(cè)，用pWPXL-miR-208a 慢病毒顆粒感染表達(dá)miR-208a 的小鼠心肌細(xì)胞株；流式細(xì)胞儀分選表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性細(xì)胞，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得可以傳代的穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.8Western-blot法檢測(cè)p21蛋白水平表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白后，取等量蛋白，在12%的SDS-PAGE凝膠中電泳后，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素濾膜上，封閉2 h后，孵育一抗，4 ℃過夜。PBS室溫漂洗4次，孵育二抗，1 h后洗膜，曝光。

1.9細(xì)胞周期分析 將生長狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長至50%融合度，轉(zhuǎn)染小RNA，24 h后加入Nocodazole，使細(xì)胞同步化，16 h后換成完全培養(yǎng)基，釋放6 h后收集細(xì)胞。細(xì)胞用胰酶消化，冷PBS洗2次，用300 μL PBS重懸細(xì)胞，再緩緩加入-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇700 μL，混勻后置于-20 ℃固定過夜。次日，先用1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，冷PBS洗2次，再用含有RNA酶(終濃度5 mg/L)的PBS 500 μL重懸細(xì)胞，37 ℃處理30 min；后加入PI 5 μL，室溫避光染色30 min，流式細(xì)胞儀FACSCalibur檢測(cè)，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，并用ModFit LT V3.0軟件分析結(jié)果。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CH小鼠miR-208a和p21的表達(dá) 病理組織學(xué)H-E染色可見：與Sham組比較，CH組的心肌細(xì)胞體積增大；Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，CH組的p21表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05，圖1)。

心臟組織RNA水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CH組中的miR-208a明顯增多，而p21-mRNA明顯減少，且二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(圖2)。

A:H-E染色結(jié)果(上：4×；下：40×);B:p21蛋白檢測(cè),與假手術(shù)組比較，☆☆:P≤0.001.圖1 假手術(shù)組和心肌肥厚組H-E染色結(jié)果和p21蛋白的表達(dá)情況Fig 1 The difference of H-E staining and p21 protein expression between Sham group and CH group

A:miR-208a; B:p21-mRNA; C:miR-208a和p21-mRNA關(guān)系.圖2 miR-208a和p21-mRNA在小鼠假手術(shù)組和心肌肥厚組的表達(dá)Fig 2 The difference expression of miR-208a and p21-mRNA between Sham group and CH group

2.2miR-208a通過結(jié)合p21 3′-UTR下調(diào)p21表達(dá) miR-208a可以下調(diào)野生型p21-3′-UTR-熒光素酶的活性，但不影響突變型p21-3′-UTR-熒光素酶的活性(圖3A)。同時(shí)，在心肌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-208a模擬物及miR-208的抑制劑，從而使得心肌細(xì)胞中miR-208a過表達(dá)或表達(dá)下調(diào)，結(jié)果表明，過表達(dá)miR-208a后心肌細(xì)胞中p21的mRNA及蛋白水平均出現(xiàn)明顯下調(diào)(圖3B，C)；相反，抑制miR-208a的表達(dá)后心肌細(xì)胞中p21的蛋白水平則呈上調(diào)(圖3C)。

2.3miR-208a促進(jìn)心肌細(xì)胞周期G1-S期的轉(zhuǎn)化

流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-208a時(shí)，G1期的細(xì)胞數(shù)明顯減少，S期細(xì)胞數(shù)明顯增加；抑制miR-208a表達(dá)后，G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞數(shù)減少(圖4)。

A:雙熒光素酶檢測(cè);B:過表達(dá)miR-208a后p21的mRNA水平的檢測(cè); C:過表達(dá)miR-208a和抑制miR-208a表達(dá)后的p21蛋白水平的檢測(cè). NC：對(duì)照組；miR-208a:過表達(dá)miR-208a組；anti-NC:陰性對(duì)照組；anti-miR-208a:抑制miR-208a組. 兩兩比較，☆☆☆:P≤0.000 1.圖3 miR-208a通過結(jié)合p21 3′-UTR下調(diào)p21的表達(dá)Fig 3 miR-208a down-regulates p21 expression by directly targeting p21 3′-UTR

過表達(dá)miR-208a和抑制miR-208a表達(dá)后, G1期(A)、S期(B)及G2/M期(C)細(xì)胞數(shù)的變化. 兩兩比較,☆:P≤0.05,☆☆:P≤0.001.圖4 miR-208a促進(jìn)心肌細(xì)胞周期G1-S期的轉(zhuǎn)化Fig 4 miR-208a promotes cell cycle G1/S transition in cardiomyocyte

3 討 論

miR-208a是miR-208家族成員之一，由α-心肌β-MCH基因的內(nèi)含子編碼。早期的研究發(fā)現(xiàn)，在miR-208a轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，隨著miR-208a的過表達(dá)，小鼠心肌細(xì)胞體積明顯增大，心室壁增厚，出現(xiàn)明顯的CH，在此過程中，β-MCH也隨著增加。當(dāng)miR-208a缺失時(shí)，甲狀腺激素核受體輔助因子(Med13)受到抑制，從而抑制β-MCH的表達(dá)，也就不會(huì)出現(xiàn)CH[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-208a通過靶向作用于CATA結(jié)合蛋白4(GATA4)，參與CH[19]。miR-208a在CH的機(jī)制探討上，有研究還發(fā)現(xiàn)，miR-208a能通過上調(diào)內(nèi)皮素的表達(dá)水平而發(fā)揮促進(jìn)CH的作用[20]，但是現(xiàn)有的研究仍然沒有完全明確miR-208a促進(jìn)CH的機(jī)制。本研究著眼于CH的直觀表現(xiàn)——心肌細(xì)胞體積增大，通過miR-208a和細(xì)胞周期調(diào)控因子p21的表達(dá)水平，探討其機(jī)制。

由于現(xiàn)有的研究已經(jīng)明確miR-208a促進(jìn)CH的進(jìn)展，所以本研究未建立miR-208a轉(zhuǎn)基因小鼠模型，僅通過主動(dòng)脈縮窄手術(shù)建立CH的小鼠模型，以此檢測(cè)miR-208a和p21的表達(dá)水平。而且近年的研究表明，在大鼠心肌細(xì)胞中，通過AngⅡ或血清誘導(dǎo)細(xì)胞肥大損傷后，可以看到p21的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)合成增多，最終出現(xiàn)CH的表現(xiàn)[21-22]。結(jié)合本研究的結(jié)果，無論是蛋白質(zhì)水平，還是RNA水平，p21在CH的小鼠中表達(dá)均減少。提示p21可能參與CH的進(jìn)程。

有學(xué)者通過高通量篩選能調(diào)控p21表達(dá)的miRNA發(fā)現(xiàn)，28個(gè)miRNA中就包含了心臟特異性表達(dá)的miR-208a[11]。結(jié)合本研究的結(jié)果，在CH的小鼠中，miR-208a的表達(dá)增加，且與p21-mRNA負(fù)相關(guān)。提示miR-208a促進(jìn)CH的發(fā)生、發(fā)展可能是通過下調(diào)p21的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。因此，本研究還在體外設(shè)計(jì)了可穩(wěn)定表達(dá)miR-208a的心肌細(xì)胞株，通過對(duì)miR-208a過表達(dá)和抑制miR-208a的表達(dá)后，對(duì)心肌細(xì)胞株行Western-blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-208a可以在轉(zhuǎn)錄后水平靶向負(fù)調(diào)控p21的表達(dá)。

p21作為細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，下調(diào)p21的表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞周期G1-S期的轉(zhuǎn)化，促使細(xì)胞分裂增殖。但由于心肌細(xì)胞喪失了有絲分裂的能力，心肌細(xì)胞數(shù)量并不會(huì)增加，表現(xiàn)出的是體積增大(CH)。若miR-208a是通過下調(diào)p21的表達(dá)來促進(jìn)CH，miR-208a必然也能促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化。因此，本研究還對(duì)體外細(xì)胞株使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-208a過表達(dá)后處于G1期的細(xì)胞數(shù)明顯減少，S期數(shù)量明顯增多，而抑制miR-208a表達(dá)后，這種趨勢(shì)不再存在。這與前期設(shè)想是一致的。

綜上所述，本研究表明了miR-208a靶向負(fù)調(diào)控p21的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期G1-S期轉(zhuǎn)化，以此參與CH的發(fā)生、發(fā)展過程，為CH的基因治療提供新思路。