白扁豆中派可林酸的定性定量研究

陳丹 李柯 侯茜 吳梅青 李若存

【摘 要】? 目的：建立白扁豆中派可林酸的定性定量研究方法。方法：采用TLC法對派可林酸進(jìn)行鑒別;采用HPLC建立派可林酸的含量測定方法，采用2，4-二硝基氟苯柱前衍生，色譜柱為Hypersil BDS C18 （4.6mm×250mm，5μm），以乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸鈉溶液（21∶ 0.5∶ 79） 為流動(dòng)相，檢測波長為390nm，流速為lmL/min，柱溫30℃。結(jié)果：在TLC色譜中檢出派可林酸;派可林酸在4.6～46μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，r=0.9992，加樣回收率為97.61%～104.83%，RSD為2.79%。結(jié)論：該方法可靠，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

【關(guān)鍵詞】 白扁豆;定性定量研究;高效液相色譜法;派可林酸

【中圖分類號】R284.1? ?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2019）16-0056-04

Abstract：Objective To establish qualitative and quantitative methods for Pipecoline acid of Lablab semen album. Methods Pipecoline acid was identified by TLC.The contents of Pipecoline acid was determined by HPLC.The sample was derivatized with chiral compound 2，4-Dinitrofluorobenzene and the separarion was performed on a Hypersil BDS C18 column （4.6mm×250mm， 5μm） by using the mobile phase consisted of CⅡ3CN-（CⅡ3）2NCOⅡ-0.025mol/L CH3COONa（21∶ 0.5∶ 79）， the flow rate was 1 mL/min， the detection wavelength was set at 390nm and the column temperature at 30℃. Results Pipecoline acid can be distinguished and has good separation. The linear range of Pipecoline acid was 4.6～46μg/mL （r=0.9992）. The recoveries ranged from 97.61% to 104.83%， RSD was 2.79%. Conclusion The method is reliable，accurate and reproducible.

Keywords：Lablab Semen Album; Qualitative and Quantitative Analysis; HPLC; Pipecoline Acid

白扁豆系豆科植物扁豆Dolichos lablab L.的干燥成熟種子，為常用的藥食兩用植物，分布廣泛，應(yīng)用歷史悠久，具有健脾化濕，和中消暑的功效。富含脂肪、多糖、蛋白質(zhì)、鈣、鐵、磷、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，臨床多用于脾胃虛弱，食欲不振，大便溏泄，白帶過多，暑濕吐瀉，胸悶腹脹[1-5]。2015年版《中國藥典》中白扁豆藥材的質(zhì)量控制主要包括性狀、橫切面鑒別、水分檢查，未有定性定量指標(biāo)來評價(jià)其質(zhì)量。關(guān)于白扁豆質(zhì)量分析方面的報(bào)道較少，僅有白扁豆中總磷脂的含量測定[6]。課題組通過對白扁豆的作用研究，發(fā)現(xiàn)其所含派可林酸具有明顯降低番瀉葉致小鼠腹瀉模型小腸運(yùn)動(dòng)的作用[7]。研究以派可林酸為指標(biāo)成分，對10個(gè)不同產(chǎn)地12批次白扁豆藥材進(jìn)行定性定量分析，以提高和完善白扁豆藥材現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期作為白扁豆藥材的開發(fā)利用與臨床應(yīng)用的評價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 白扁豆來自河南（20170424、20170-325）、黑龍江（20160822）、江西（20160212）、云南（20160617）、湖南（20160618、20160824）、廣西（20161005、20160826）、貴州（20160524）、安徽（20160924、20161015）8個(gè)省份，共12批次，均由湖南省中醫(yī)藥研究院李若存研究員鑒定為豆科植物扁豆Dolichos lablab L.的干燥成熟種子。對照品派可林酸（批號111751-200601）均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀（SPD-20A紫外-可見檢測器，SHIMADZU LabSolution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，日本島津）;XPE-105十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo）;HX-06型超聲波清洗器（武漢恒信世紀(jì)科技有限公司）;HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;ZN-200A高速中藥粉碎機(jī);80-2離心沉淀器;101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）;硅膠G薄層色譜板（青島化工）;0.45μm微孔濾膜（Hypersil）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 取白扁豆樣品，每批適量，分別粉碎，過80目篩，每批取粉末各2g，分別加水20mL，加熱回流20min，離心，取上清液，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇5mL使溶解，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。另取派可林酸對照品適量，加稀乙醇分別制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液10μL，對照品溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶ 2.2∶ 1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，如圖1所示。

2.2 含量測定[8-12]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）;檢測波長：390nm;流動(dòng)相：乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸鈉溶液（21∶ 0.5∶ 79）;流速：1.0mL/min;柱溫：室溫;理論板數(shù)按派可林酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取派可林酸對照品約10mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻;精密量取1mL，置10mL具塞試管中，加水1mL，加0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L碳酸氫鈉溶液2mL，于60℃水浴中1h，取出放冷，移至10mL量瓶中，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）分?jǐn)?shù)次洗滌溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取白扁豆藥材粉末（批號：20170424）約1.0g，精密稱定，置10mL具塞試管中，加水適量，充分振搖后，于60℃水浴中加熱30min，取出，放冷，移至10mL量瓶中，用水分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液并入量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。離心（12000r/min）10min，精密量取上清液2mL，置10mL具塞試管中，加0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L碳酸氫鈉溶液2mL，于60℃水浴中1h，取出放冷，移至10mL量瓶中，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）分?jǐn)?shù)次洗滌溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按2.2.1色譜條件測定，即得。結(jié)果如圖2所示。

2.2.5 線性關(guān)系考察 取派可林酸對照品約10mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻;分別精密吸取0.2、 0.5、1、1.5、2mL，置10mL具塞試管中，分別加水1.8、1.5、1、0.5、0mL，加0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L碳酸氫鈉溶液2mL，于60℃水浴中1h，取出放冷，移至10mL量瓶中，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）分?jǐn)?shù)次洗滌溶器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得。按2.2.1色譜條件測定其峰面積，以派可林酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：y=（5E+06）x+57506，r=0.9992。結(jié)果表明派可林酸在4.6～46μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，派可林酸峰面積的RSD為1.50%，說明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號：20170424），分別在0、4、8、12、24h精密吸取10μL，進(jìn)樣測定，計(jì)算結(jié)果RSD為0.59%，說明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品（批號：20170424）6份，分別制備供試品溶液，測定、計(jì)算。結(jié)果6份樣品平均含量為1.60 mg/g，RSD為1.28%，說明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的白扁豆樣品（批號：20170424）粉末6份，每份約0.5g，向各份樣品中精密加入派可林酸對照品溶液（每1mL含派可林酸0.23mg）3.5mL，照供試品溶液的方法制備，按上述條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，平均值為101.15%， RSD為2.79%。結(jié)果見表1。

2.2.10 12批白扁豆測定數(shù)據(jù) 分別取12批白扁豆，按2.2.3供試品溶液制備方法制備供試品溶液，每批兩份，分別精密吸取各供試品溶液10μL，進(jìn)樣，按2.2.1色譜條件，依法測定峰面積，計(jì)算各供試液中派可林酸的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取溶劑的考察 分別采用水、40%乙醇及乙醇對白扁豆進(jìn)行提取，提取液衍生后測定，結(jié)果用水作溶劑，派可林酸含量最高，但水作溶劑，提取后溶液較難過濾，因此須采用離心的方法。

3.2 衍生劑用量的考察 試驗(yàn)中比較了衍生劑的用量1mL、2mL、3mL，結(jié)果加1mL 0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液作衍生劑，雖然派可林酸含量與加2mL或3mL差不多，但由于峰面積對比可知，衍生劑用量為1.0mL時(shí)并未反應(yīng)完全，說明衍生化不完全，加2mL或3mL 0.8%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液作衍生劑，派可林酸含量與峰面積均相差不大，因此選擇2mL。

3.3 衍生溫度的考察 比較了40℃、60℃、80℃水浴中各放置1h，結(jié)果40℃下制備的供試液與對照品溶液派可林酸峰面積最小，說明衍生化不完全，置于60℃或80℃水浴中1h，派可林酸峰面積與含量無差別，因此選擇60℃。

3.4 含量測定結(jié)果分析 應(yīng)用所建立的方法對12批白扁豆中派可林酸進(jìn)行含量測定，12批平均含量為0.13%，最高含量0.24%，最低含量為0.06%，其中含量大于0.08%的有10個(gè)樣品，占全部樣品的83.3%。

研究建立了派可林酸定性、定量測定方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，建議進(jìn)一步增加樣本量，制定合理的限度，同時(shí)對派可林酸的藥效深入研究，從而更加科學(xué)、全面地控制白扁豆的質(zhì)量。

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（收稿日期：2019-06-18 編輯：劉 斌）