超高效液相色譜法測定不同黃酒中17種氨基酸的分析研究

田 翔，王君杰，秦慧彬，喬治軍

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所，山西太原 030031；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原 030031；3.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原 030031）

黃酒是山西、陜西、浙江、山東等地極具特色的民間食俗，深受當(dāng)?shù)丶爸苓叺貐^(qū)民眾所喜愛。傳統(tǒng)黃酒主要以稻米、糜米[1-3]、小麥等為原料，經(jīng)選米、浸泡、蒸米、加曲、發(fā)酵、過濾、滅菌等環(huán)節(jié)而成，酒色黃里透紅，入口微甜，香氣濃郁。黃酒特殊的發(fā)酵工藝保留了大部分對人體有益的營養(yǎng)成分，而且在其發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些易被人體吸收利用的功能性成分，如低聚糖、氨基酸、酚類等[4-6]，具有較高的營養(yǎng)保健價值。黃酒中的蛋白質(zhì)多以肽和氨基酸的形態(tài)存在，肽具有營養(yǎng)和生物調(diào)節(jié)功能。其中，黃酒中的氨基酸是一類重要的營養(yǎng)素[7]，主要來自原料及微生物的代謝作用，是黃酒中一類重要的營養(yǎng)素，對評價黃酒的品質(zhì)至關(guān)重要。謝廣發(fā)等[8]研究發(fā)現(xiàn)，黍米黃酒中含有豐富的氨基酸。尚小利等[6]研究黍米釀造工藝發(fā)現(xiàn)黍米黃酒營養(yǎng)價值較高。目前，實驗室測定氨基酸的方法有很多，常見的有全自動氨基酸儀、高效液相色譜法[9-11]、毛細(xì)管電泳法[12]、離子交換色譜法[13]、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[14]等，全自動氨基酸儀和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)成本較高，不易普及，而柱前衍生-超高效液相色譜法由于不需要特殊的反應(yīng)裝置，并且分析時間短、靈敏度較高[15-17]而被廣泛應(yīng)用于氨基酸分析。文獻報道所用的柱前衍生劑主要有異硫氰酸苯酯（PITC）、鄰苯二甲醛（OPA）、6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯（AQC）[18]等，其中，AQC可與一級和二級氨基酸迅速反應(yīng)，生成穩(wěn)定的衍生物，且副產(chǎn)物6-氨基喹啉對測定無影響，衍生物有強的紫外吸收，適用于二極管檢測器檢測。本文建立了一種以AQC為衍生試劑的柱前衍生-超高效液相色譜法測定黃酒中氨基酸含量的方法，兼顧分離度、靈敏度和分析速度。相比普通高效液相色譜儀大大提高了樣品通量，降低了檢測成本。市場上黃酒品牌很多，以江、浙、滬為代表的南方黃酒占據(jù)主要黃酒市場，北方黃酒相對知名度較低。目前不同黃酒產(chǎn)品營養(yǎng)成分的對比研究比較缺乏，因此，對我國不同產(chǎn)地黃酒中的多種氨基酸進行對比分析，以明確不同產(chǎn)地黃酒品質(zhì)差異性，遏制黃酒市場上以次充好行為，對實現(xiàn)黃酒產(chǎn)品的原產(chǎn)地保護和產(chǎn)地鑒別具有重要的實際意義，對黃酒的營養(yǎng)成分及保健功能提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Waters ACQUITY UPLC（H-Class），配二極管陣列檢測器，AccQ·TagTM Ultra氨基酸分析柱（1.7μm，2.1×100 mm）；EmpowerTM 3工作站；氮吹儀（Thermo）；Milli-Q超純水裝置（美國Millipore公司）；渦旋振蕩器；恒溫干燥箱。

17種氨基酸水解標(biāo)準(zhǔn)溶液（美國Agilent公司）；AccQ·TagTMUltraEluent A（醋酸鹽緩沖溶液，pH5.2，美國Waters公司）；AccQ·TagTM Ultra Eluent B（60%乙腈，美國Waters公司）；AccQ·TagTM Ultra Derivitization Kit，包括硼酸緩沖液、衍生劑粉末2A（6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯）、溶劑2B（乙腈），美國Waters公司提供。本實驗共用4種黃酒，分別為陜西產(chǎn)糜子酒、浙江產(chǎn)糯米黃酒、紹興產(chǎn)糯米黃酒、山西產(chǎn)糜子酒。

1.2 實驗方法

1.2.1 衍生劑配制

將水浴鍋預(yù)熱至55℃，吸取2B瓶中1 mL乙腈清洗移液管后，吸取1 mL溶劑2B放入裝有白色衍生劑粉末的2A瓶中，加蓋密封，將其渦旋振蕩15 s后放置1 min，最后將混合溶液放入55℃的烘箱中加熱，直至白色粉末全部溶解，4℃保存待用。

1.2.2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品用超純水分別配制成濃度為20μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L以及400μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液[19]。

1.2.3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化

將烘箱預(yù)熱至55℃，用移液槍準(zhǔn)確量取10μL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液至1.5 mL離心管底部，加入70μL硼酸緩沖液，渦旋混勻后，量取20μL衍生劑溶液至樣品瓶中，立即渦旋混合15 s，加蓋密封，置于55℃烘箱中加熱反應(yīng)10 min，取出備用。按下式計算測定結(jié)果[20]：

式中：ρ為樣品中被測氨基酸組分的含量（mg/g）；F為稀釋倍數(shù)；c為被測氨基酸組分測得的濃度（mmol/L）；V為樣品水解液最后定容的體積（mL）；M為被測氨基酸組分的摩爾質(zhì)量（g/mol）；m為稱樣量（mg）。

1.2.4 樣品溶液的制備

移取1mL過濾黃酒樣品于10 mL離心管中，用氮氣濃縮，用超純水定容至1 mL，過0.22μm濾膜后備用，作為樣品溶液。

1.2.5 樣品溶液的衍生

用移液槍準(zhǔn)確量取10μL供試樣品溶液按照1.2.3方法操作。

1.2.6 色譜條件

色譜柱：AccQ·Tag Ultra,1.7μm，2.1×100 mm；流動相A：Elute A；流動相B：10%EluteB；流動相C：超純水；流動相D：Elute B；柱溫：49℃；流速0.7 mL/min；梯度洗脫（見表1）；檢測波長：260 nm；進樣量1μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性

按照實驗方法，將17種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液依次進樣，混合氨基酸衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液各種氨基酸濃度125μmol/L，分離色譜圖見圖1、圖2。從圖1、圖2可看出，17種氨基酸完全分離。

2.2 線性關(guān)系考察

對1.2.2中配制的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行衍生并測定，采用外標(biāo)法定量。以待測物的積分面積對其相應(yīng)的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進行線性回歸，得到17種氨基酸的回歸方程[21]。在線性范圍內(nèi)，氨基酸衍生物的積分面積與其濃度的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.9993，具體結(jié)果見表2。

2.3 重復(fù)性及回收率檢測

表1 梯度洗脫

圖1 17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品衍生物色譜圖

圖2 浙江產(chǎn)黃酒氨基酸衍生物色譜圖

選取某一個黃酒酒樣，分為6份，按照本文方法進行處理，分別進行氨基酸含量測定，計算RSD，以考察方法的重復(fù)性[22]，其RSD均小于5%。選取某一個黃酒酒樣，將其作為空白基質(zhì)，添加氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液做加標(biāo)回收率實驗，加標(biāo)水平分別為75μmol/L、100μmol/L、150μmol/L，按照本文方法測定其氨基酸含量，加標(biāo)回收率在94.21%～104.82%之間。

2.4 黃酒中氨基酸含量測定及分析

運用本文所建立的樣品前處理方法及分析檢測方法，對所選取的4種不同產(chǎn)地的黃酒進行處理并測定，測定結(jié)果見表3。

經(jīng)過對4個黃酒樣品的測試可知，黃酒中含有豐富的游離態(tài)氨基酸，本方法能夠滿足對黃酒中17種氨基酸含量的同時測定。從氨基酸的分布來看，浙江產(chǎn)糯米黃酒的總游離氨基酸含量最高，達到2351.6 mg/L，17種氨基酸全部檢出，紹興產(chǎn)糯米黃酒和陜西產(chǎn)糜子酒中氨基酸含量次之，分別為2288.95 mg/L和1346.97 mg/L，而山西糜子酒含量最低，氨基酸總含量只有684 mg/L。浙江產(chǎn)糯米黃酒氨基酸相對含量較高的有絲氨酸（411.36 mg/L），酪氨酸（385.07 mg/L）；紹興產(chǎn)糯米黃酒中所含氨基酸含量較高的有精氨酸（366.00 mg/L），酪氨酸（343.48 mg/L），；陜西糜子酒中氨基酸含量較高的有脯氨酸（281.27 mg/L），丙氨酸（165.88 mg/L）；而山西糜子酒中含量最高的氨基酸為丙氨酸（86.47 mg/L）。

表2 17種氨基酸的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)

表3 不同的黃酒中17種游離氨基酸的含量

此外，陜西糜子酒、浙江產(chǎn)糯米黃酒、紹興產(chǎn)糯米黃酒和山西糜子酒這4種不同產(chǎn)地的黃酒中均含有人類必需的7種氨基酸（蘇氨酸、賴氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸），其含量分別為520.95 mg/L、1201.03 mg/L、1055.94 mg/L和330.97 mg/L，分別為總游離氨基酸含量的38.68%、51.07%、46.13%和48.39%。不同的黃酒樣品中總氨基酸含量及分布和必需氨基酸所占比例均有差異，這可能是由于不同產(chǎn)地的黃酒，其釀造原料和發(fā)酵過程的不同或釀造過程中蛋白質(zhì)分解差異有關(guān)。氨基酸含量的高低可決定黃酒的營養(yǎng)價值，因此，從營養(yǎng)價值和保健功能的角度看，本次樣品中浙江產(chǎn)糯米黃酒的營養(yǎng)價值最高。

本研究通過采用柱前衍生-超高效液相色譜法分別對市場上隨機選取陜西糜子黃酒、浙江產(chǎn)糯米黃酒、紹興產(chǎn)糯米黃酒、山西糜子酒這4種不同產(chǎn)地的黃酒中游離氨基酸含量進行測定，建立了樣品的分析檢測方法，在11 min內(nèi)17種游離氨基酸完全分離，在較低濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率在94.21%～104.82%之間，具有快速、準(zhǔn)確、高分離度等優(yōu)勢。據(jù)文獻報道，原糧中糯米的蛋白含量平均為8%，糜子約為13%，而本研究結(jié)果顯示，糯米黃酒總氨基酸含量較高，可能是由釀造過程原料的微生物分解的差異造成。對酒的風(fēng)味評分有正面影響的甜味氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸)的含量，糯米黃酒較高，糜子黃酒較低。對黃酒口感具有負(fù)面影響的澀味的酪氨酸在糜子類黃酒中最低。通過對4種不同黃酒中氨基酸進行分析，發(fā)現(xiàn)4種黃酒氨基酸含量豐富且所含的人體必需氨基酸也比較豐富，具有較高的營養(yǎng)價值。

3 結(jié)論

本研究對不同產(chǎn)地的黃酒中游離氨基酸含量的測定提供了可靠的分析檢測方法，并進一步證實了黃酒的營養(yǎng)價值和保健養(yǎng)生功能。下一部分可將原料糜子或糯米的蛋白含量與黃酒氨基酸含量進行關(guān)聯(lián)性分析，篩選釀造型專用原料。期望對不同黃酒的營養(yǎng)價值提供可靠的理論依據(jù)，也為糧食資源的深度開發(fā)利用，提高其產(chǎn)品附加值開辟了新的道路。促進黃酒產(chǎn)業(yè)的傳承、保護和開發(fā)，推動我國黃酒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。