超高壓結合胰蛋白酶消減蝦原肌球蛋白致敏性及其抗原線性表位殘留

胡志和，王麗娟，薛 璐，劉 平，賈 瑩，魯丁強

（天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

食物過敏反應是人體對食物中抗原產(chǎn)生的超敏反應，特別在發(fā)達國家和地區(qū)食物過敏的患病率越來越高[1]，嚴重影響患者及其家庭的生活質量，尤其對兒童的影響甚至比慢性兒童疾病更為嚴重[2]。蝦類雖然味道鮮美，卻是引起食物過敏的一類重要過敏原[3]。在食物過敏人群中，約有20%的過敏患者對蝦過敏，在兒童過敏患者中發(fā)病率高達60%[4]。研究發(fā)現(xiàn)，蝦類的過敏原蛋白主要包括原肌球蛋白（tropomyosin，TM）、精氨酸激酶、肌球蛋白輕鏈以及肌漿鈣結合蛋白，致敏率分別為80%、51%、57%和45%[5]。蝦類過敏原的研究主要集中在TM。自Shanti等[6]確定印度對蝦以及Daul等[7]確定褐對蝦（Penaeus aztecus）的主要過敏原是TM以來，研究者先后研究了刀額新對蝦[8]、龍蝦[9]、磷蝦[10-11]、凡納濱對蝦[12]、中國對蝦[13]、蝦蛄[11]及其他蝦蟹等甲殼類[14]水產(chǎn)品的TM，這些甲殼類水產(chǎn)品TM的一級結構、空間結構、分子質量及抗原性質（構象表位和線性表位）等具有高度一致性。

近年來，研究的重點轉移到如何消減其致敏性方面。致敏性消減主要采用物理法、化學法和生物法，由于原料和產(chǎn)品的要求不同，所采用的方法也不同。在物理法中，主要有加熱、輻照、超聲波、超高壓及熱與超高壓結合等方法。Yu Huilin等[15]采用煮沸加熱、超聲波與煮沸加熱、高壓蒸汽加熱等方法處理TM，發(fā)現(xiàn)高壓蒸汽加熱能夠較好地促進過敏原的消減；Li Zhenxing等[16]采用輻照方法處理蝦的提取蛋白，發(fā)現(xiàn)當輻照劑量大于10 kGy時，蝦過敏原蛋白的致敏性才有顯著下降；Zhang Ziye等[17]采用高強度超聲波處理白蝦（Exopalaemon modestus）的TM，能夠使半胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）和賴氨酸（Lys）發(fā)生氧化，TM發(fā)生降解，導致α-螺旋含量降低，β-折疊、β-轉角及無規(guī)卷曲含量增加，進而促進TM的有效水解和致敏性的降低；胡志和等[18]采用超高壓處理凡納濱對蝦的TM，發(fā)現(xiàn)適當?shù)母邏禾幚砟軌蛳麥pTM的致敏性，且致敏性與TM的三級結構的變化密切相關；Long Fangyu等[19]采用超高壓結合熱加工的方法處理凡納濱對蝦的TM，在55 ℃、500 MPa下處理10 min，TM與免疫球蛋白E（immune globulin E，IgE）的結合能力降低了73.59%?；瘜W法消減TM致敏性常采用的方法有酸水解法、美拉德反應和小分子絡合反應等。Fu Linglin等[20]將核糖、低聚半乳糖和低聚殼聚糖分別與TM進行美拉德反應，其反應產(chǎn)物的致敏性降低了60%，且α-螺旋向β-折疊轉化；Lü Liangtao等[21]采用2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）與蝦的TM作用，發(fā)現(xiàn)AAPH能夠通過TM的聚集誘發(fā)其結構變化，進而降低TM的致敏性；另外，其還將4-羥基-2-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal，HNE）與蝦的TM進行作用，當HNE濃度大于0.5 mmol/L時，TM與IgE的結合能力顯著下降[22]。Ahmed等[23]將酪氨酸酶與咖啡酸共同作用于蝦的TM，發(fā)現(xiàn)咖啡酸能夠促進酪氨酸酶與TM的交聯(lián)，改變TM的空間結構，降低其致敏性。生物法消減TM致敏性，主要采用的方法有酶法、微生物法、酶與高壓結合法。吳海明等[24-25]采用胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶分別水解蝦TM粗提物和蝦肉，發(fā)現(xiàn)這3 種酶對蝦蛋白的致敏性均有較好的消減作用；謝丹丹[26-27]和賈瑩[28]等采用酶與超高壓結合處理蝦TM粗提物、蝦肉和蝦仁，發(fā)現(xiàn)高壓下酶水解TM與常壓下酶水解TM相比，前者對TM致敏性消減效果更好；李鴻雁等[29]采用乳酸菌發(fā)酵蝦肉有效降低了TM的致敏性。

雖然有學者采用不同手段處理TM消減其致敏性，對TM的線性表位進行了預測[30-31]，但鮮有從線性表位殘留的角度分析酶水解效果與致敏性殘留的關系。本研究采用超高壓結合胰蛋白酶法處理凡納濱對蝦的TM，通過比較常壓下酶水解與超高壓下酶水解產(chǎn)物的致敏性差異及線性表位的殘留，分析水解產(chǎn)物致敏性消減的效果，為超高壓結合酶消減過敏原致敏性提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凡納濱對蝦的TM（純度為97.65%） 天津商業(yè)大學食品專業(yè)實驗室制備；胰蛋白酶、苯胺基萘磺酸（8-anilino-1-naphthalene-sulfonate，ANS）、兔抗南美白對蝦TM-IgG抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體 美國Sigma公司；其他實驗試劑（均為分析純）天津市凱通化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Nicolet5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；F-4600熒光分光光度計 日本日立高新技術公司；HPP.L2-1000/1型超高壓設備超高壓實驗機 天津華泰森淼生物工程技術有限公司；DC-2030節(jié)能型智能恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；SpectraMax190光吸收酶標儀 美國美谷分子儀器有限公司；FDU-810型冷凍干燥機 日本東京理化公司；Triple TOF 5600質譜儀 美國SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 超高壓處理胰蛋白酶最適條件的確定

用磷酸鹽緩沖溶液（pH 8.0）將胰蛋白酶配制成0.1 mg/mL酶液，取5 mL酶液真空密封于聚乙烯密封袋，采用不同壓力處理30 min，確定使酶活力最高的壓力；在所確定壓力下保壓不同時間（0、10、20、30、40、50 min），確定適宜的保壓時間。采用福林-酚法測定胰蛋白酶活力[32]。

1.3.2 常壓下胰蛋白酶水解TM最適條件的確定

用磷酸鹽緩沖溶液（pH 8.0）將TM配制成質量分數(shù)為3%的溶液，在40 ℃、不同酶添加量（以TM溶液質量計）（0（對照）、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500 U/g）下，水解30 min，水解物經(jīng)冷凍干燥后，采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法[18]檢測水解產(chǎn)物的致敏性，以OD492nm表征致敏性，致敏性消減率按照下式計算，以確定適宜消減TM致敏性的酶解條件。

1.3.3 超高壓處理TM及相關指標的測定

1.3.3.1 超高壓處理TM

將TM用超純水溶解，配制成質量濃度為2 mg/mL的溶液，真空密封包裝。選取不同的壓力（0.1（對照組）、100～900 MPa），在40 ℃下處理30 min，取出后冷凍干燥，對其進行指標測定。

1.3.3.2 TM傅里葉變換紅外光譜掃描

稱取2 mg經(jīng)冷凍干燥的TM與100 mg KBr充分混合研磨，壓片后，采用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm－1范圍內(nèi)進行掃描。采用EZ OMNIC軟件分析TM二級結構。

1.3.3.3 TM熒光光譜掃描

將冷凍干燥的TM用磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）配制成0.1 mg/mL的溶液，取4 mL TM溶液，加入20 μL的ANS外源熒光探針溶液（5.0 mmol/L）。常溫下避光反應1 h后，激發(fā)波長280 nm，在320～380 nm范圍內(nèi)進行熒光光譜掃描。

1.3.3.4 TM的致敏性

根據(jù)文獻[18]的方法檢測超高壓處理后TM的致敏性。

1.3.4 超高壓結合酶水解TM及相關指標的測定

1.3.4.1 常壓下酶水解超高壓處理的TM

將不同超高壓條件下（0.1、100～900 MPa）處理的TM用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液溶解成質量分數(shù)為3%的溶液，在1.3.2節(jié)所確定的最佳水解條件下進行水解，采用間接ELISA法檢測水解產(chǎn)物的致敏性。

1.3.4.2 超高壓結合胰蛋白酶水解TM

采用1.3.1節(jié)所確定的有利于提高酶活力的條件，結合1.3.2節(jié)所確定的水解條件，對TM在超高壓下進行水解，并檢測其致敏性變化。具體方法為，將TM用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液配制質量分數(shù)為3%的溶液，加胰蛋白酶3 000 U/g，在200 MPa、溫度40 ℃下水解時間30 min，檢測其致敏性變化。

1.3.5 常壓下水解產(chǎn)物與超高壓下酶法水解產(chǎn)物線性抗原表位殘留測定

此部分委托深圳華大基因公司進行檢測。將TM在常壓下和超高壓（200 MPa）下水解（40 ℃、加酶量3 000 U/g、30 min）的產(chǎn)物，采用Triple TOF 5600質譜儀進行片段的氨基酸序列檢測，所用主要軟件為Maxquant v1.5.2.8。標準生物信息分析使用數(shù)據(jù)庫：CBI（add_target_Litopenaeus_vannamei_nr.fasta，709 sequences）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Litopenaeus＋vannamei）；搜索鑒定采用Maxquant軟件，在分析過程中，用于非特異性搜索的肽段長度最小為8 個氨基酸殘基，最大為40 個氨基酸殘基。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，結果采用平均值±標準差表示；應用配對t檢驗分析各組之間差異的顯著性，P＜0.05表明有顯著性差異。圖表制作利用Origin 8.6和Excel 2007軟件進行。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對胰蛋白酶活力的影響

圖 1 超高壓處理對胰蛋白酶活力的影響Fig. 1 Effect of ultra-high pressure treatment on trypsin activity

由圖1A可知，在實驗條件壓力范圍內(nèi)，處理胰蛋白酶30 min，其活力隨壓力的增加呈先增加后降低的趨勢。當壓力在0.1～200 MPa范圍內(nèi)，隨壓力升高，胰蛋白酶活力上升，在200 MPa時胰蛋白酶的活力達到最大值，為223 U/mg，比對照0.1 MPa組提高39.38%；當壓力在200～800 MPa范圍內(nèi)，隨壓力升高胰蛋白酶活力下降，800 MPa時，胰蛋白酶的活力為137 U/mg，比對照組降低14.38%；但在壓力小于400 MPa的范圍內(nèi)，胰蛋白酶的活力均高于對照組。

在200 MPa處理0～50 min，胰蛋白酶活力變化如圖1B所示。在保壓時間0～30 min范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力上升，當保壓時間為30 min時，胰蛋白酶活力達到最大值；在保壓時間40～50 min內(nèi)，胰蛋白酶活力開始下降，當保壓時間為50 min時，胰蛋白酶活力為152 U/mg，比對照組降低5%；但在保壓時間小于40 min的范圍內(nèi)，胰蛋白酶的活力均高于對照組。

綜上，在實驗條件范圍內(nèi)，能夠較好提高胰蛋白酶活力的條件為：溫度40 ℃、壓力200 MPa、保壓時間30 min。該結果與賈瑩[28]和劉平[33]等的實驗結果基本一致。酶活力在超高壓下隨壓力的增加和處理時間的延長呈現(xiàn)的變化與其二級結構中α-螺旋和β-轉角的峰面積之比、酪氨酸及色氨酸等疏水氨基酸殘基暴露程度有關[34]。超高壓改變胰蛋白酶酶活性中心的非共價鍵，使活性中心部分暴露，從而使酶空間結構發(fā)生改變，進而改變酶活力[33,35]。

2.2 常壓條件水解對TM產(chǎn)物致敏性的影響

圖 2 常壓條件下酶添加量對TM產(chǎn)物致敏性消減率的影響Fig. 2 Effect of trypsin-to-TM ratio on allergenicity reduction of TM

在胰蛋白酶水解TM過程中，酶與底物比例不同，其水解效率不同，且水解產(chǎn)物片段的大小也存在差異，導致水解產(chǎn)物的致敏性不同[26]。由圖2可知，隨著酶添加量（0～3 500 U/g）的增加，水解產(chǎn)物的致敏性（OD492nm）逐漸降低，致敏性消減率逐漸提高。在酶的添加量不小于3 000 U/g時，TM水解產(chǎn)物的致敏性消減率為89%。

2.3 超高壓處理對南美白對蝦TM結構及其免疫原性關系的影響

2.3.1 超高壓處理引發(fā)TM的二級結構變化

圖 3 不同壓力處理后TM的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of TM treated at different pressures

圖3為經(jīng)不同壓力處理后的TM傅里葉變換紅外光譜圖；經(jīng)OMNIC軟件分析，TM二級結構的相對含量變化見圖4，TM的二級結構以α-螺旋為主，該結果與Lyon等[36]采用自優(yōu)化預測法預測的TM二級結構含量基本一致，但與圓二色光譜法檢測的二級結構含量[18]存在差異。

圖 4 不同壓力處理TM二級結構變化Fig. 4 Changes in secondary structures of TM treaded at different pressures

由圖4可知，在100～600 MPa范圍內(nèi)，隨處理壓力升高，TM的α-螺旋相對含量增大，600 MPa時達到最大（94.8%），隨后降低，但變化不大。在100～600 MPa范圍內(nèi)，隨壓力增大，β-轉角相對含量呈現(xiàn)下降的趨勢；500、600 MPa處理組與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；當壓力大于600 MPa后，其相對含量出現(xiàn)上升。對于無規(guī)卷曲，100～900 MPa范圍內(nèi)，隨壓力的增大，其相對含量變化無規(guī)律性，但600～700 MPa范圍內(nèi)與對照組（0.1 MPa）相比差異顯著（P＜0.05）。隨壓力的增大，β-折疊相對含量變化無規(guī)律性。該檢測結果與圓二色光譜法檢測的結果[19]存在差異性，可能與檢測方法不同有關。

2.3.2 熒光光譜檢測超高壓處理后TM的氨基酸微環(huán)境（三級結構）變化

由圖5、表1可知，在40 ℃不同壓力（0.1、100～900 MPa）下處理30 min，TM的最大發(fā)射波長的紅移和藍移變化不明顯；熒光強度呈一定規(guī)律性變化。在100～600 MPa范圍內(nèi)，熒光強度隨著壓力增加逐漸減小，當壓力達到600 MPa時，熒光強度最低；700～900 MPa范圍內(nèi)，熒光強度隨壓力增加而升高。熒光強度的變化主要是在不同壓力條件下疏水性氨基酸的暴露或掩蔽程度不同造成的。由此可見，隨處理壓力的變化，TM氨基酸微環(huán)境（三級結構）發(fā)生變化，導致空間構象的變化。

圖 5 不同壓力處理后的TM熒光光譜圖Fig. 5 Fluorescence spectra of TM treated at different pressures

表 1 不同壓力下處理TM的發(fā)射波長和熒光強度Table 1 Changes in emission wavelength and fluorescence intensity of TM treated at different pressures

2.3.3 不同壓力處理引發(fā)TM的致敏性變化

圖 6 不同壓力下處理對TM致敏性的影響Fig. 6 Effect of high hydrostatic pressure on allergenicity of TM

如圖6所示，在100～600 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力的增加，致敏性不斷降低，600 MPa時致敏性降至最低（OD492nm＝0.075）。600～900 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力增大，OD492nm逐漸增加，但在900 MPa時，其致敏性仍然小于對照組。所以超高壓處理對TM的免疫原性有一定的消減作用。這是因為TM在經(jīng)過超高壓處理后，蛋白質內(nèi)的非共價鍵發(fā)生變化，引起其空間結構發(fā)生了改變，從而導致生物活性變化，體現(xiàn)為致敏性的變化，由于處理溫度、時間和壓力的不同，其結果也存在差異[18]。Long Fangyu等[19]發(fā)現(xiàn)經(jīng)55 ℃、500 MPa處理10 min的蝦TM與沸水加熱組相比，其與IgE的結合能力降低了73.59%；雖然與本實驗條件不同，但結果均能說明超高壓能有效降低TM的致敏性。

2.3.4 TM結構變化與致敏性的關系

TM在100～600 MPa超高壓處理條件下，β-轉角相對含量的變化趨勢與TM致敏性變化趨勢有一定的相關性（圖7）；壓力超過500 MPa后，β-轉角相對含量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。

圖 7 壓力引發(fā)TM二級結構（β-轉角相對含量）變化與致敏性的關系Fig. 7 Relationship between changes in secondary structure (β-turn relative content) of TM caused by high pressure processing and its allergenicity

超高壓處理后TM的熒光強度變化趨勢與其致敏性變化具有很好的相關性（圖8），特別是在0.1～600 MPa范圍內(nèi)，變化趨勢一致；但當壓力大于600 MPa，其致敏性低于對照組，而熒光強度卻高于對照組，這可能是由于超高壓處理TM的致敏性變化是由二級和三級變化共同引起，是一個綜合現(xiàn)象，具體原因還需要進一步研究。

圖 8 不同壓力處理TM熒光強度變化與致敏性的關系Fig. 8 Relationship between fluorescence intensity of TM caused by high pressure processing and its allergenicity

2.4 超高壓結合酶法對南美白對蝦TM致敏性消減效果的影響

2.4.1 先超高壓再胰蛋白酶水解消減TM致敏性

先經(jīng)不同壓力處理，再經(jīng)胰蛋白酶水解（酶添加量3 000 U/g、40 ℃水解30 min）后，TM致敏性和致敏性消減率的結果如圖9所示，經(jīng)超高壓處理后，氨基酸微環(huán)境（三級結構）的變化會導致水解位點的暴露或掩蔽，從而導致水解產(chǎn)物出現(xiàn)差異，進而使得水解產(chǎn)物致敏性的不同。在100～600 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力的增大，水解產(chǎn)物的致敏性逐漸降低，致敏性的消減率逐漸增強，在600～900 MPa范圍內(nèi)，隨壓力增加，水解產(chǎn)物的致敏性逐漸增大，致敏性消減率逐漸降低。

圖 9 先超高壓處理再胰蛋白酶水解對TM 致敏性消減率的影響Fig. 9 Effect of high pressure treatment followed by trypsin hydrolysis on allergenicity reduction of TM

與對照組（0.1 MPa處理組）相比，壓力在100～200 MPa范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物致敏性相對增加，且100 MPa處理組與對照組差異顯著（P＜0.05）；壓力在300～600 MPa范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物的致敏性小于對照組，且500～600 MPa下處理后水解產(chǎn)物的致敏性顯著低于對照組；當壓力在700～900 MPa范圍內(nèi)，水解產(chǎn)物的致敏性又有所升高，但與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。從結果可知，在500～600 MPa范圍內(nèi)處理TM，再用胰蛋白酶水解，可以顯著降低水解產(chǎn)物致敏性（600 MPa處理后的水解物致敏性消減率為96%），其原因可能是由于在此壓力范圍內(nèi)處理后再用酶水解，更有利于TM線性表位的消除。

2.4.2 超高壓下胰蛋白酶水解TM

在有利于提高酶活力的超高壓條件（溫度40 ℃、壓力200 MPa、保壓時間30 min）下水解TM（TM質量分數(shù)3%、酶添加量3 000 U/g、壓力200 MPa、溫度40 ℃、水解時間30 min），檢測其致敏性變化。結果顯示，在該條件下TM水解產(chǎn)物的OD492nm為0.006±0.001，致敏性消減率為98%，較常壓下TM水解產(chǎn)物的致敏性消減率（89%）（圖2）提高了9%。

針對該差異的原因，對常壓下的水解產(chǎn)物和超高壓下的水解產(chǎn)物用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析（圖10），從泳道4和5的比較可以發(fā)現(xiàn)，在超高壓下酶水解TM效果更好，水解更加徹底。但由于TM水解后線性表位的分子質量較小，在SDS-PAGE中無法體現(xiàn)，因此在兩種條件下的水解產(chǎn)物能夠引發(fā)致敏性的線性表位殘留情況還需要進一步分析。

圖 10 超高壓下蝦蛋白水解物SDS-PAGE圖Fig. 10 SDS-PAGE analysis of TM hydrolysates under high pressure

2.5 常壓下酶水解產(chǎn)物與超高壓下酶水解產(chǎn)物線性抗原表位殘留

表 2 常壓下TM水解物中的肽段種類Table 2 Peptides in trypsin hydrolysates under the normal pressure

為了進一步研究TM在常壓下水解產(chǎn)物和超高壓下水解產(chǎn)物在致敏性方面的差異，將2.3.2節(jié)中水解獲得的產(chǎn)物采用質譜儀進行片段檢測。如表2所示，常壓下TM水解產(chǎn)物中共有11 類233 個片段，片段長度分布見圖11；超高壓下TM水解產(chǎn)物中共有11 類90 個片段（表3），片段長度分布見圖12。

從線性抗原表位消除效果分析，目前公開發(fā)表的資料顯示，國內(nèi)學者預測蝦的TM線性抗原表位有10 個[31]，國外學者預測的TM線性抗原表位有9 個[32]。常壓下TM水解產(chǎn)物片段種類（11 類、233 個片段）（表2）中，與國內(nèi)學者預測的線性抗原表位相比，殘留4 個線性抗原表位（表2中波浪線片段），線性抗原表位消減率為60.0%，在233 個水解片段中，含有線性抗原表位的片段共12 個（表2中括號外數(shù)值）；與國外學者預測線性抗原表位相比，殘留線性抗原表位3 個（表2中下劃線片段），消減率為66.7%，在233 個水解片段中，含有線性抗原表位的水解片段7 個（表2中括號內(nèi)數(shù)值）；參考國內(nèi)和國外學者預測的線性抗原表位，其線性抗原表位的消減率為60.0%～66.7%。

圖 11 常壓下TM水解物中的肽段長度分布Fig. 11 Peptide length distribution in TM hydrolysate under normal pressure

表 3 超高壓下TM水解產(chǎn)物的肽段種類Table 3 Peptides in TM hydrolysate under high pressure

超高壓下TM水解產(chǎn)物片段種類（11 類、90 個片段）（表3），與國內(nèi)學者預測線性抗原表位相比，殘留1 個線性抗原表位（表3中波浪線片段），線性抗原表位消減率為90.0%，在90 個水解片段中，含有線性抗原表位的水解片段只有1 個；與國外學者預測的線性抗原表位相比，殘留1 個線性抗原表位（表3中下劃線片段），表位消減率為88.9%，在90 個水解片段中，含有線性抗原表位的水解片段只有3 個（表3中括號內(nèi)數(shù)值）；參考國內(nèi)和國外學者預測的線性抗原表位，其線性抗原表位消減率為88.9%～90.0%。因此，從線性抗原表位消減效果分析，超高壓下水解TM，更有利于其線性抗原表位的消除。

比較TM水解產(chǎn)物片段的氨基酸殘基數(shù)量，在常壓下TM水解產(chǎn)物的233 個片段中，含8～16 個氨基酸殘基的片段數(shù)量占76.8%，大于16 個氨基酸殘基的片段數(shù)量占23.2%（圖11）；在超高壓下TM水解產(chǎn)物的90 個片段中，含8～16 個氨基酸殘基的片段數(shù)量占93.3%，大于16 個氨基酸殘基的片段數(shù)量占6.7%（圖12）。因此，TM在超高壓下水解，產(chǎn)物的片段小，水解較徹底，更有利于線性抗原表位的消除。

圖 12 超高壓下TM水解物中的肽段長度分布Fig. 12 Peptide length distribution in TM hydrolysate under high hydrostatic pressure

3 結 論

TM是蝦的主要過敏原，采用常壓下酶水解或超高壓處理，其致敏性消減效果相對較差。采用超高壓與酶水解相結合的方法，即超高壓下酶水解TM，在較低壓力、適宜溫度和酶與底物比下進行處理，不僅可以提高酶活力，提高水解效率，而且水解徹底，更有利于線性表位的消除，進而提高致敏性的消減效率。