超高壓對(duì)帶魚魚糜凝膠特性及其肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響

陳燕婷，林 露，高 星，羅華彬，張進(jìn)杰，樓喬明，徐大倫，楊文鴿*

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

帶魚（Trichiurus haumela）是我國(guó)主要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類，年捕獲量約110萬 t，尤其在浙江省，帶魚捕撈量約占全國(guó)總量的40%[1]。目前市場(chǎng)上的大規(guī)格帶魚往往直接鮮銷或加工成冷凍品，而大量小規(guī)格帶魚多用于制備魚糜，以緩解海水魚糜加工原料不足的問題。但由于帶魚肉脂肪含量較高，鹽溶蛋白含量相對(duì)較低，所制得的魚糜凝膠強(qiáng)度較低、色澤較差，帶魚魚糜的凝膠品質(zhì)有待改善[2-4]。魚糜凝膠品質(zhì)與其凝膠化方式密切相關(guān)，目前魚糜凝膠化主要以熱處理為主，但在改善魚糜凝膠品質(zhì)方面，通過熱誘導(dǎo)形成凝膠的加工方法仍不夠理想。

作為一種非熱加工技術(shù)，超高壓處理具有殺菌、鈍化酶活力和延長(zhǎng)食品保質(zhì)期等作用[5]，同時(shí)超高壓會(huì)改變蛋白質(zhì)等生物大分子的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、凝膠化[6-7]，在合適的壓力和保壓時(shí)間下，能提高食品蛋白的凝膠形成能力[8]。Ma Xingsheng[9]、Ma Fei[10]等研究表明，超高壓處理可改善肉類鹽溶蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性和持水性，其發(fā)現(xiàn)六齒金線魚魚糜經(jīng)400 MPa處理10 min，其破斷力和持水率均顯著高于熱處理組，并形成了致密、均一的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠特性明顯改善；馬海建等[11]發(fā)現(xiàn)超高壓處理有利于草魚魚糜凝膠品質(zhì)的提升，且在340 MPa、保壓12 min后魚糜的凝膠強(qiáng)度和質(zhì)構(gòu)特性總體達(dá)到最佳。

本實(shí)驗(yàn)以帶魚魚糜為原料，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選到幾組較合適的超高壓處理參數(shù)，并進(jìn)一步研究超高壓處理對(duì)魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)、白度、凝膠強(qiáng)度、微觀結(jié)構(gòu)及其肌原纖維蛋白含量的影響，確定合適的超高壓處理?xiàng)l件，同時(shí)結(jié)合圓二色光譜（circular dichroism，CD）分析肌原纖維蛋白構(gòu)象單元組成，探討超高壓誘導(dǎo)魚糜凝膠的形成機(jī)制，旨在為超高壓技術(shù)在魚糜及其制品加工中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍帶魚魚糜（－20 ℃凍藏） 寧波飛日水產(chǎn)實(shí)業(yè)有限公司；食鹽（食品級(jí)） 寧波市鹽業(yè)有限公司；聚偏二氯乙烯腸衣（食品級(jí)，直徑25 mm） 南通皇佳腸衣有限公司。

叔丁醇、戊二醇、無水乙醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ML104/02型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UMC 5型真空斬拌機(jī) 德國(guó)Stephan Machinery公司；CQC2L-600超高壓設(shè)備 北京速原中天股份有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國(guó)Stable Micro Systems 公司；CR-400色差計(jì) 日本Konica Minolta公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Biofuge Stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo Scientific Sorvall公司；SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀美國(guó)Molecular Devices公司；J-1500-150 CD儀 日本分光株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

帶魚魚糜4 ℃解凍，置于真空斬拌機(jī)空斬2 min，加冰水調(diào)節(jié)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)至80%，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%食鹽后繼續(xù)擂潰8 min，全程溫度控制在10 ℃以下。將斬拌后的魚糜灌入直徑為25 mm的腸衣中，得到長(zhǎng)度約100 mm的魚腸，兩頭扎緊。

魚腸經(jīng)超高壓處理形成凝膠為超高壓誘導(dǎo)組，超高壓條件：350 MPa下分別保壓5、8 min，400 MPa下保壓5、6.5 min和8 min，分別記為350-5、350-8、400-5、400-6.5、400-8；魚腸經(jīng)二段加熱（40 ℃加熱60 min后90 ℃加熱30 min）形成凝膠為熱誘導(dǎo)組，記為H；未處理的魚腸為對(duì)照組，記為C。各組魚腸處理后，冰水迅速冷卻，4 ℃保存，取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的測(cè)定

將魚腸平衡至20 ℃，去腸衣，切成25 mm高的柱體。使用P/50探頭，進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析（texture profile analysis，TPA）。測(cè)試參數(shù)為：預(yù)壓速率1.0 mm/s、下壓速率5.0 mm/s、回復(fù)速率1.0 mm/s、感應(yīng)力5 g、壓縮比50%，用儀器自帶軟件TPA.MAC處理結(jié)果。

1.3.3 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

參考Kudre等[12]方法，并略作修改。將魚腸切成25 mm小段，質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定魚糜凝膠強(qiáng)度。測(cè)定參數(shù)為：壓縮力模式、P/0.5S球形探頭、測(cè)前速率1.0 mm/s、測(cè)中速率1.0 mm/s、測(cè)后速率10 mm/s、壓縮比50%。

1.3.4 凝膠白度的測(cè)定

色度分析前，用標(biāo)準(zhǔn)白板校正色差儀。每個(gè)魚腸樣品測(cè)量3 個(gè)不同部位，結(jié)果取平均值，白度為L(zhǎng)*（明亮度）、a*（紅綠偏差）和b*（黃藍(lán)偏差）值的綜合指標(biāo)，按照下式計(jì)算。

1.3.5 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

將魚腸切成約1 mm3小塊，體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定凝膠，24 h后用磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.2）漂洗3 次，依次用體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、70%、80%、90%乙醇及無水乙醇梯度洗脫，隨后按V（無水乙醇）：V（叔丁醇）＝3∶1、1∶1、1∶3比例及純叔丁醇依次洗脫，最后用少量叔丁醇覆蓋樣品，冷凍干燥，貼樣、鍍金后用于掃描電子顯微鏡觀察，加速電壓為15 kV。

1.3.6 肌原纖維蛋白提取及含量測(cè)定

參考Xiong Guangquan等[13]方法。取2 g魚腸樣品于離心管中，加10 倍體積20 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液（含0.05 mol/L KCl，pH 7.0），充分勻漿，離心（10 000 r/min、10 min），沉淀加入10 倍體積20 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0），充分勻漿，靜置提取1 h后10 000 r/min離心10 min，上清液即為肌原纖維蛋白溶液。以上操作均在2～4 ℃下進(jìn)行，采用福林-酚法測(cè)定肌原纖維蛋白含量。

1.3.7 肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

采用CD儀，選用光徑為0.1 cm的石英樣品池，在遠(yuǎn)紫外區(qū)（190～250 nm）對(duì)0.2 mg/mL肌原纖維蛋白溶液進(jìn)行掃描，掃描速率為50 nm/min，0.25 s響應(yīng)，測(cè)定溫度25 ℃。根據(jù)CD譜圖，通過儀器自帶軟件計(jì)算出肌原纖維蛋白分子中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。圓二色性用平均殘基橢圓度[θ]表示，單位為deg/（cm2·dmol）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)平行3～5 次，數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Origin 9.0軟件繪圖，采用SPSS 21軟件單因素方差分析中的Duncan法檢驗(yàn)差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對(duì)魚糜質(zhì)構(gòu)特性的影響

圖1顯示了帶魚魚糜的質(zhì)構(gòu)特性隨處理?xiàng)l件的變化。與對(duì)照組和熱誘導(dǎo)組相比，超高壓處理使帶魚魚糜的硬度、咀嚼性顯著上升（P＜0.05），黏聚性和彈性顯著優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.05），但略低于熱誘導(dǎo)組。這可能是因?yàn)槌邏禾幚硎刽~糜體積縮小，有助于魚糜蛋白之間化學(xué)鍵和疏水作用力的形成，使結(jié)構(gòu)更加緊湊，表現(xiàn)出更佳的內(nèi)聚性與彈性，形成硬度和咀嚼性更好的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14]。

圖 1 超高壓對(duì)魚糜凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 1 Effect of UHP on the gel strength of surimi

當(dāng)壓力為350 MPa時(shí)，350-8組魚糜凝膠的硬度、咀嚼性和黏聚性均顯著高于350-5組（P＜0.05）；但當(dāng)壓力為400 MPa時(shí)，硬度、咀嚼性和彈性隨加壓時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，黏聚性呈下降的趨勢(shì)。不同魚糜由于原料特性的差異，壓力和保壓時(shí)間對(duì)其凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響不同。余輝等[15]測(cè)定鼬鳚魚糜-大豆分離蛋白復(fù)合物時(shí)發(fā)現(xiàn)，壓力小于300 MPa時(shí)，硬度、彈性、咀嚼性均隨著壓力升高而逐漸增大，繼續(xù)升高壓力，硬度反而顯著減小，而彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性則無顯著變化。這與馬海建等[11]研究的草魚魚糜制品質(zhì)構(gòu)特性的影響相似。胡飛華[16]用400 MPa保壓10 min獲得最優(yōu)的梅魚魚糜質(zhì)構(gòu)特性，且明顯優(yōu)于熱處理組。

2.2 超高壓處理對(duì)魚糜凝膠強(qiáng)度的影響

圖 2 超高壓對(duì)魚糜凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 2 Effect of UHP on the gel strength of surimi

凝膠強(qiáng)度是較為重要的凝膠性能指標(biāo)，如圖2所示，相比于對(duì)照組，熱誘導(dǎo)處理能顯著提高魚糜的凝膠強(qiáng)度，超高壓處理效果又顯著高于熱誘導(dǎo)組（P＜0.05）。在超高壓誘導(dǎo)組中，除400-5組外，其余4 組魚糜凝膠強(qiáng)度沒有顯著差異（P＞0.05），其中350-8組凝膠強(qiáng)度最高。馬海建等[11]研究表明，超高壓處理可明顯提升魚腸的凝膠形成能力，300 MPa下魚腸的凝膠強(qiáng)度達(dá)到最高。超高壓處理提高魚糜的凝膠強(qiáng)度，一方面可能是由于超高壓抑制了魚糜內(nèi)源性蛋白酶的活性，另一方面超高壓誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致巰基氧化形成二硫鍵，疏水性氨基酸暴露于分子表面[17]，而二硫鍵和疏水相互作用是維持魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要作用力，超高壓通過增強(qiáng)魚糜蛋白之間二硫鍵和疏水相互作用力的形成，促進(jìn)魚糜凝膠形成，提高魚糜凝膠強(qiáng)度[18-19]。

2.3 超高壓處理對(duì)魚糜白度的影響

表 1 超高壓處理對(duì)魚糜白度的影響Table 1 Effect of UHP on the whiteness of surimi

不同處理?xiàng)l件下帶魚魚糜白度的變化見表1。與對(duì)照組相比，超高壓和熱處理均能顯著增加魚糜白度、L*值，但熱誘導(dǎo)組增加更為明顯；對(duì)a*值和b*值，超高壓和熱處理的影響恰好相反，超高壓導(dǎo)致魚糜a*值和b*值下降，而熱處理后a*值和b*值顯著增加（P＜0.05）。在相同的壓力下，保壓時(shí)間延長(zhǎng)，a*值逐漸減小，而b*值沒有明顯的變化規(guī)律。超高壓和熱處理后魚糜白度、L*值增加，原因在于高壓或加熱均能誘導(dǎo)魚糜形成凝膠，凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能截留更多的水分從而減少光的散射[20-21]。Tabilo-Munizaga等[22]發(fā)現(xiàn)，超高壓顯著改善太平洋鱈魚魚糜凝膠的白度，并認(rèn)為超高壓引起魚糜凝膠色澤變化的原因可能是壓力作用下肌紅蛋白中球蛋白發(fā)生變性，或肌紅蛋白中的亞鐵血紅素被取代或失去，導(dǎo)致a*值下降、L*值增加。根據(jù)優(yōu)質(zhì)魚糜凝膠標(biāo)準(zhǔn)[23-24]，即高亮度、低黃度、高白度，350-8、400-8組結(jié)果比較合適。

2.4 魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的分析

通過掃描電子顯微鏡放大10 000 倍觀察，可看出超高壓組、熱誘導(dǎo)組魚糜凝膠與對(duì)照組魚糜的結(jié)構(gòu)有明顯不同。對(duì)照組魚糜尚未形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；而熱誘導(dǎo)組魚糜的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密且均勻，交聯(lián)度較高；經(jīng)超高壓處理后，魚糜均形成了一定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。與350-5組相比，350-8組凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為緊密；400 MPa處理組中，400-5組的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較為緊密，交聯(lián)程度高，400-6.5組和400-8組的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得較疏松，交聯(lián)度有所下降。這是由于在適宜條件的超高壓處理后，魚糜蛋白之間由于疏水、靜電及氫鍵相互作用的改變，導(dǎo)致其發(fā)生聚集和交聯(lián)，蛋白質(zhì)即開始出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[25]，但壓力過大會(huì)使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞[26-27]。儀淑敏等[28]研究金線魚魚糜亦有類似結(jié)論。總體上，帶魚魚糜經(jīng)350 MPa處理8 min，其凝膠網(wǎng)絡(luò)微觀結(jié)構(gòu)與熱誘導(dǎo)組接近，這與其凝膠的質(zhì)構(gòu)特性、白度的結(jié)果一致。

圖 3 不同處理?xiàng)l件下的魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)Fig. 3 Effect of UHP on the microstructure of surimi gel

2.5 超高壓處理對(duì)魚糜肌原纖維蛋白含量的影響

圖 4 超高壓處理對(duì)魚糜肌原纖維蛋白含量的影響Fig. 4 Effect of UHP on the content of myofibrillar proteins in surimi

由圖4可以看出，超高壓和熱處理均引起肌原纖維蛋白含量顯著下降，其中熱誘導(dǎo)組肌原纖維蛋白含量下降最為顯著（P＜0.05）。同加熱能引起蛋白變性相似，Tan等[29]認(rèn)為高壓通過影響蛋白質(zhì)分子間的相互作用鍵（氫鍵、疏水相互作用、靜電力），能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)變性、聚集或凝集；李仁杰等[30]指出超高壓通過壓縮蛋白質(zhì)分子體積，改變其非共價(jià)鍵，引起蛋白質(zhì)解聚、分子結(jié)構(gòu)伸展等變化；周果等[31]認(rèn)為當(dāng)壓力大于250 MPa時(shí)，過高的壓力會(huì)導(dǎo)致蛋白變性，變性蛋白的鹽溶能力下降，因此肌原纖維蛋白含量降低。

2.6 超高壓處理對(duì)肌原纖維蛋白構(gòu)象的影響

不同處理?xiàng)l件下，魚糜肌原纖維蛋白的CD見圖5，其二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的相對(duì)含量如圖6所示。由圖5可知，對(duì)照組魚糜肌原纖維蛋白在209 nm和220 nm附近兩個(gè)負(fù)峰明顯，表明有豐富的α-螺旋構(gòu)象單元。經(jīng)超高壓或熱處理，魚糜肌原纖維蛋白CD譜中的兩個(gè)負(fù)槽逐漸消失，說明α-螺旋含量有所降低。王瑋等[32]發(fā)現(xiàn)超高壓處理降低了酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋的比例，但秦影等[33]研究表明超高壓處理的大黃魚魚糜凝膠蛋白中α-螺旋含量顯著增加，無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量顯著下降，β-折疊含量無明顯變化，可見不同原料蛋白對(duì)超高壓的敏感程度不一，由此產(chǎn)生不同程度的構(gòu)象變化。

圖 5 超高壓處理對(duì)魚糜肌原纖維蛋白CD譜圖的影響Fig. 5 Effect of UHP on the CD spectrum of myofibrillar proteins in surimi

圖 6 超高壓處理對(duì)肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的影響Fig. 6 Effect of UHP on the relative content of secondary structure in myofibrillar proteins

結(jié)合圖6可知，與對(duì)照組相比，超高壓和熱處理均對(duì)肌原纖維蛋白的構(gòu)象單元組成產(chǎn)生影響，其中α-螺旋相對(duì)含量下降，無規(guī)卷曲相對(duì)含量上升，說明在凝膠化過程中魚糜蛋白緊密的螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)則狀態(tài)轉(zhuǎn)變。在5 組超高壓處理組中，350-8組魚糜凝膠中的肌原纖維蛋白有更多的無規(guī)卷曲和更少的β-折疊結(jié)構(gòu)，而各組α-螺旋相對(duì)含量基本接近；隨著所加壓力由350 MPa增大至400 MPa，肌原纖維蛋白β-折疊相對(duì)含量增加，無規(guī)卷曲相對(duì)含量下降，說明壓力的增加并不利于魚糜蛋白向無規(guī)則狀態(tài)轉(zhuǎn)變。熱誘導(dǎo)組肌原纖維蛋白中的α-螺旋相對(duì)含量最低（16.68%），β-折疊（33.55%）及無規(guī)卷曲（43.08%）相對(duì)含量較高，超高壓處理組中，350-8組肌原纖維蛋白的無規(guī)卷曲相對(duì)含量接近熱誘導(dǎo)組，這與其凝膠微觀結(jié)構(gòu)最接近熱誘導(dǎo)組一致。

3 結(jié) 論

超高壓和熱處理均能提升帶魚魚糜的質(zhì)構(gòu)、凝膠強(qiáng)度、白度，并且形成一定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而改善魚糜凝膠品質(zhì)。不同條件的超高壓（350-5、350-8、400-5、400-6.5、400-8）處理，其魚糜凝膠的白度較熱誘導(dǎo)組低，但質(zhì)構(gòu)、凝膠強(qiáng)度及肌原纖維蛋白含量均優(yōu)于熱誘導(dǎo)組，可用于誘導(dǎo)魚糜凝膠化反應(yīng)。尤其是經(jīng)350 MPa處理8 min，魚糜質(zhì)構(gòu)、凝膠強(qiáng)度及白度均優(yōu)于其他超高壓誘導(dǎo)組，其凝膠網(wǎng)絡(luò)微觀結(jié)構(gòu)與熱誘導(dǎo)組接近。同時(shí)，超高壓和熱處理均引起肌原纖維蛋白含量顯著下降，魚糜肌原纖維蛋白CD譜中的兩個(gè)負(fù)峰逐漸消失，α-螺旋相對(duì)含量有所降低，其中熱誘導(dǎo)組下降最為顯著。超高壓誘導(dǎo)組中，350-8組肌原纖維蛋白的無規(guī)則卷曲相對(duì)含量最高，并與熱誘導(dǎo)組接近，認(rèn)為在凝膠化過程中魚糜蛋白緊密的螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)則狀態(tài)轉(zhuǎn)變?？梢?，超高壓處理可以作為改善魚糜凝膠品質(zhì)的有效手段，就帶魚魚糜而言，合適的超高壓處理?xiàng)l件為350 MPa處理8 min。