兩種檢測生鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶的方法比對

郝苗苗 ，徐偉良 ，3，李春冬 ，3， 孫春玲

（1.錫林郭勒職業(yè)學院，內(nèi)蒙古錫林浩特 026000；2.錫林郭勒食品檢驗檢測和風險評估中心，內(nèi)蒙古錫林浩特 026000；3.錫林郭勒生物工程研究院，內(nèi)蒙古錫林浩特 026000）

乳及乳制品在生產(chǎn)、加工過程中抗生素的殘留嚴重危害人體健康[1-3]。近年來，隨著國家對生鮮乳品質(zhì)監(jiān)控力度加大，一些不法分子為了謀求經(jīng)濟利益，通過人為添加β-內(nèi)酰胺酶以分解乳中的抗生素類藥物，使“高抗奶”變?yōu)椤盁o抗奶”[4]。2001年9月，我國農(nóng)業(yè)部頒布了《無公害食品生鮮牛乳》行業(yè)標準，規(guī)定生鮮乳中“不得檢出”抗生素[5]。衛(wèi)生部于2009年3月發(fā)布了《全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求》和《全國打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導原則和方案》的通知，明確指出β-內(nèi)酰胺酶是非食品用物質(zhì)且屬違法添加劑。

常用的β-內(nèi)酰胺酶檢測方法主要有微生物法、理化檢測法、儀器檢測法、免疫法和試劑盒檢測等方法?，F(xiàn)今常使用的檢測方法為微生物法中的杯蝶法[6-9]、快速檢測的試劑盒法[10-12]，2種方法各有優(yōu)缺點。因此，試驗研究對比杯蝶法與試劑盒法的差異，以供人們在檢測過程中根據(jù)實際需求選擇最優(yōu)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣品為10份生鮮奶樣；藤黃微球菌（Micrococcus luteus） CMCC（B）28001，中國醫(yī)學細菌保藏管理中心提供；β-內(nèi)酰胺酶標準品（600萬U/mL），中國食品藥品檢定研究院提供；青霉素G標準品（99.8%）、舒巴坦（99.4%），Dr.Ehrentorfer公司提供；0.1 mol/L Tris-HCl溶液（pH值7.0，含 0.1%BSA）；抗生素檢定培養(yǎng)Ⅱ號、營養(yǎng)瓊脂、腦心浸液培養(yǎng)基，北京陸橋公司提供；無水磷酸二氫鉀，無水磷酸氫二鉀，國藥公司提供；β-內(nèi)酰胺酶殘留試劑盒，勤幫生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 杯蝶法[6]

1.2.1 菌懸液的制備

將藤黃微球菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，于36℃下培養(yǎng)24~36 h直至長出單個菌落。挑取單菌落于無菌的5 mL腦心浸液培養(yǎng)基，經(jīng)36℃下培養(yǎng)20~24 h至菌液渾濁，測定菌懸液濃度在1×108~1×109CFU/mL，菌懸液應(yīng)在4℃下保藏5 d內(nèi)使用。

1.2.2 樣品的制備

將待檢樣品充分混勻，取1mL待檢樣品分別置于4支1.5 mL離心管中，分別標為A，B，C，D，每個樣品做3個平行，共12管。同時做陽性對照和陰性對照樣品，陽性對照樣品為滅菌后并經(jīng)檢測為陰性的牛乳，經(jīng)添加β-內(nèi)酰胺酶標準品至終質(zhì)量濃度為0.5 U/L。陰性對照樣品為滅菌后并經(jīng)檢測為陰性的牛乳。制備操作同待檢樣品。

1.2.3 檢測用平板的制備

菌懸液按1∶20加入到無菌約50℃的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號中，充分搖勻。取無菌培養(yǎng)皿，加入15 mL含菌的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號，凝固后在其表面放置4個無菌牛津杯，備用。

1.2.4 樣品的測定

各離心管標準物質(zhì)添加量見表1。

表1 各離心管標準物質(zhì)添加量

按照表1分別將青霉素G標準溶液、β-內(nèi)酰胺酶標準溶液、舒巴坦標準溶液加入到待檢樣品及陽性/陰性對照樣品中?；靹蚝螅瑢⑸鲜鯝~D試樣各取200 μL加入放置于檢測用平板上的4個無菌牛津杯中，于36℃下培養(yǎng)18~22 h，測量抑菌圈直徑。每個樣品取3次平行試驗平均值。

1.2.5 結(jié)果判定

陰性對照樣品應(yīng)A，B，D產(chǎn)生抑菌圈，且A，B抑菌圈直徑差異<3 mm，C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，且抑菌圈直徑差異≥3 mm，且3次平行試驗結(jié)果一致。陽性對照樣品應(yīng)B，D產(chǎn)生抑菌圈，且A抑菌圈直徑小于B抑菌圈直徑，差異≥3 mm，C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，且抑菌圈直徑差異≥3 mm，且3次平行試驗結(jié)果一致。以對照組結(jié)果為前提，檢測系統(tǒng)成立，可對樣品結(jié)果進行如下判定：

（1） 若樣品結(jié)果中B，D產(chǎn)生抑菌圈，且C抑菌圈直徑小于D抑菌圈，抑菌圈直徑差異≥3 mm，3次平行試驗結(jié)果一致時，進行如下判定：①A抑菌圈直徑小于B抑菌圈直徑，差異≥3 mm，3次平行試驗結(jié)果一致，則判定該樣品檢出β-內(nèi)酰胺酶，報告β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果為陽性。②A，B抑菌圈差異<3 mm，3次平行試驗結(jié)果一致，則判定該樣品未檢出β-內(nèi)酰胺酶，報告β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果為陰性。

（2）當樣品結(jié)果中A不產(chǎn)生抑菌圈且B產(chǎn)生的抑菌圈<11 mm或A、B均不產(chǎn)生抑菌圈，應(yīng)將樣品稀釋10倍，再按照該方法進行檢測。

1.3 試劑盒法

將樣品與試劑條恢復(fù)至室溫，迷你金屬浴提前預(yù)熱至35℃。從試劑桶中取出白色微孔試劑，開蓋，吸取250 μL均勻樣品至該微孔中，充分混勻，蓋好蓋板膜。將微孔放入45±5℃的恒溫箱，保溫15 min，取出后回溫3 min。取出試劑桶，打開后取出所需的紅色微孔試劑和試紙條并標記。用微量移液器吸取200 μL待檢樣本于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻，將微孔放入迷你金屬孔中，孵育3 min。在35℃條件下，將試紙條插入微孔中一手柄端向上，吸水墊端向下，并使吸水墊充分浸入溶液中，反應(yīng)3 min。從微孔中取出試紙條，輕輕刮去試紙條下端的吸水墊，并進行結(jié)果判讀。反應(yīng)完成5 min內(nèi)讀取結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

分別采用杯蝶法與試劑盒法對10份生鮮乳進行β-內(nèi)酰胺酶檢測。

杯蝶法與試劑盒法結(jié)果見表2。

表2 杯蝶法與試劑盒法結(jié)果

由表2可以看出，10份樣品經(jīng)杯蝶法檢測有3份陽性樣品，陽性檢出率為42.9%。用試劑盒法可檢測出1份陽性樣品，陽性檢測率為10%，檢出率低于杯蝶法。與試劑盒檢測相比杯碟法檢測時間過長。

3 結(jié)論

杯蝶法是微生物法測定β-內(nèi)酰胺酶的主要方法，該法采用對青霉素類藥物絕對敏感的藤黃微球菌作為標準菌株，在樣品中加入青霉素G作為對照，利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶活性的特性，通過比對加入舒巴坦與未加入舒巴坦的樣品所產(chǎn)生抑菌圈的大小，間接測定樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物。此方法對樣品進行3個平行測試，重復(fù)性好，陰陽性對照均符合標準要求，適合大批量檢測，檢測結(jié)果相對準確。

試劑盒法利用間接競爭法測定β-內(nèi)酰胺酶，其基本原理是β-內(nèi)酰胺酶可分解β-內(nèi)酰胺類抗生，通過快速測定β-內(nèi)酰胺反應(yīng)后殘留的酶含量，從而檢測牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺。根據(jù)樣本中β-內(nèi)酰胺酶含量的變化可使檢測試劑條發(fā)生顏色深淺的變化，從而進行測定。此方法適用于現(xiàn)場的快速檢測，對環(huán)境要求不高，檢測速度雖快但易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，如需進行確證仍應(yīng)按照標準的微生物杯蝶法進行確證。