張國利，吳光宗，2，王光遠，王 潼，隋文靜，田雪梅**

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省應(yīng)用真菌重點實驗室，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109）

花臉香蘑 [Lepista sordida(Schum.:Fr.)Sing.]，屬于擔(dān)子菌門 （Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 口蘑科 （Tricholomataceae） 香蘑屬（Lepista），是一種珍稀食（藥）用菌[1]。新鮮的花臉香蘑菌肉呈淺紫色，菌蓋呈淺紫色或藕粉色，有香氣散發(fā)，故又稱其為香蘑，也稱紫晶香蘑、丁香蘑、花臉蘑等[2]。該菌蛋白質(zhì)含量高，必需氨基酸種類齊全，含有豐富的具有抗氧化，增強免疫，抗衰老的硒、鍺、鋅、鐵等人體必需微量元素，具有養(yǎng)血、益神、補肝和益五臟之功效，常食有利于治療貧血崩漏、久病體虛、神疲、健忘等癥，能使肌體及時排毒并增加食欲，令人充滿活力[3]?；樝隳馕稘庀?，色澤宜人，味道鮮美，鮮食、干食風(fēng)味俱佳，是開發(fā)價值很高的優(yōu)良珍稀食（藥）用菌。目前花臉香蘑主要以野生為主，但數(shù)量稀少且隨環(huán)境條件變化有日益枯竭的趨勢。自2000年以來，國內(nèi)福建、貴州等地陸續(xù)有少量花臉香蘑人工馴化栽培的報道出現(xiàn)[4]，但有關(guān)花臉香蘑液體菌種的研究尚未見報道。

液體菌種與傳統(tǒng)固體菌種相比，具有發(fā)菌時間短、菌種活力高、發(fā)菌點多、成本低等諸多優(yōu)點，越來越多地被用于食用菌研究開發(fā)中[5]。從應(yīng)用和開發(fā)的角度出發(fā)，通過對花臉香蘑8個菌株液體菌種培養(yǎng)過程中的發(fā)酵液pH、菌絲生物量及3種胞外酶活性進行跟蹤測定和分析，以期為花臉香蘑人工馴化栽培及進一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

花臉香蘑8個菌株，編號分別為Ls1～Ls8，由山東省應(yīng)用真菌重點實驗室分離并保藏。

1.2 液體發(fā)酵條件

500 mL三角瓶，裝液量200 mL，接種量5%，150 r·min-1，25℃避光振蕩培養(yǎng) 8 d[9]。

1.3 測定項目

接種后第4天～第8天，8個菌株每天定瓶定時取20 mL發(fā)酵全液，PHS-3C型pH計測定發(fā)酵液pH并記錄。200目紗網(wǎng)過濾，所得菌球于50℃烘至恒重，計算菌絲生物量，所得濾液5 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液，測定其胞外羥甲基纖維素酶、半纖維素酶和漆酶活性，每組3個重復(fù)。

1.4 胞外酶活性測定

1.4.1 羥甲基纖維素酶活力測定

將 1%CMC-Na溶液 0.95 mL 與粗酶液 0.05 mL 充分混勻；40℃水浴30 min后立即加入DNS 1.50 mL，沸水浴5 min；冷卻后蒸餾水定容到12.50 mL，混勻；540 nm下測OD值，另取同樣酶液沸水浴5 min滅活作為對照組。每個樣品3個重復(fù)[6]。葡萄糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.263 8x-0.003，R2=0.999 1。上述條件下，每毫升粗酶液每分鐘產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需酶量定義為1個酶活力單位（U·mL-1）。

1.4.2 半纖維素酶活力測定

用 pH 4.8 的 0.2 mol·L-1Na2HPO4-C6H8O7緩沖液將粗酶液稀釋10倍，吸取0.25 mL至試管中，準(zhǔn)確取 10 mg·mL-1的木聚糖 0.75 mL放入試管中；50℃水浴30 min后立即加入DNS 1.50 mL，沸水浴5 min；冷卻后定容到12.50 mL，540 nm下測定OD值；另取同樣酶液沸水浴5 min滅活作為對照組，每組設(shè)置3個重復(fù)[7]。木糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.571x+0.009 8，R2=0.999 3。每毫升粗酶液每分鐘產(chǎn)生1 μg木糖所需酶量定義為1個酶活力單位（U·mL-1）。

1.4.3 漆酶活性測定

漆酶活性測定采用ABTS法，5 mL的酶活反應(yīng)體系中，加入 0.5 mmol·L-1的 ABTS 2.0 mL，再加入用 0.2 mol·L-1Na2HPO4-C6H8O7緩沖液稀釋 7.5 倍的粗酶液3.0 mL。將底物與酶液混勻后啟動反應(yīng)，每隔3 min記錄420 nm處吸光值的變化。每個樣品3個重復(fù)，用沸水浴滅活的粗酶液作對照[8]。每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol ABTS使產(chǎn)物ABTS自由基濃度變化的值定義為1個漆酶單位（U，U·mL-1）。計算公式如下：

式中：△A為連續(xù)2次吸光值的差值；V為反應(yīng)體系總體積；ε=3.6×104L·mol-1·cm-1；L為比色皿直徑；t為反應(yīng)時間；v為樣品體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花臉香蘑菌株發(fā)酵液pH變化情況

測定不同花臉香蘑菌株發(fā)酵液pH變化情況，結(jié)果見圖1。

圖1 不同花臉香蘑菌株發(fā)酵液pH變化情況Fig.1 The pH change in fermentation broth of different Lepista sordida strains

由圖1可知，8個菌株液體菌種培養(yǎng)的起始pH為6.10，后隨培養(yǎng)的進行pH逐漸下降，在培養(yǎng)的第8天下降至pH 5.60左右，菌株之間無明顯差異。

2.2 不同花臉香蘑菌株菌絲生物量變化情況

測定不同花臉香蘑菌株菌絲生物量變化情況，結(jié)果見圖2。

圖2 不同花臉香蘑菌株菌絲生物量變化情況Fig.2 Changes in mycelium biomass of different Lepista sordida strains

由圖2可知，隨培養(yǎng)時間的增加，參試各菌株菌絲生物量均表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，從培養(yǎng)的第6天開始，增速變緩。其中，菌株Ls5和菌株Ls3的菌絲生物量始終高于其他6個菌株，在培養(yǎng)的第8天均在8.60 g·L-1以上，其他菌株的生物量則集中在6.60 g·L-1～8.10 g·L-1之間。

2.3 不同花臉香蘑菌株胞外羥甲基纖維素酶活性測定

羥甲基纖維素酶在花臉香蘑菌絲的營養(yǎng)生長階段，對于碳源的提供起到重要的作用。測定不同花臉香蘑菌株胞外羥甲基纖維素酶活性，結(jié)果見圖3。

圖3 不同花臉香蘑菌株胞外羥甲基纖維素酶活性測定Fig.3 Determination of extracellular hydroxymethyl cellulase activity of different Lepista sordida strains

由圖3可知，供試各花臉香蘑液體菌種在培養(yǎng)過程中均可產(chǎn)生羥甲基纖維素酶，多數(shù)菌株從培養(yǎng)的第5天開始，羥甲基纖維素酶活力基本維持在30.00 U·mL-1～60.00 U·mL-1。菌株 Ls3 在培養(yǎng)的第 8天時羥甲基纖維素酶活力最高值達到93.02 U·mL-1，其次是菌株Ls7。在培養(yǎng)的第7天，除菌株Ls3和菌株Ls7羥甲基纖維素酶活力增長加快之外，其他菌株的酶活力基本趨于穩(wěn)定。根據(jù)上述試驗結(jié)果，在培養(yǎng)的第7天～第8天作為液體菌種使用時，菌株Ls3和Ls7分解纖維素類培養(yǎng)料的能力最強，生產(chǎn)潛力大。

2.4 不同花臉香蘑菌株胞外半纖維素酶活性變化情況

測定不同花臉香蘑菌株胞外半纖維素酶活性，結(jié)果見圖4。

圖4 不同花臉香蘑菌株胞外半纖維素酶活性測定Fig.4 Determination of extracellular hemicellulase activity of different Lepista sordida strains

由圖4可知，除菌株Ls7和菌株Ls6一直呈上升趨勢外，其余菌株均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，菌株Ls5和菌株Ls3的胞外半纖維素酶活力最高值出現(xiàn)在培養(yǎng)的第7天，其他4個菌株的最高值出現(xiàn)在培養(yǎng)的第6天。菌株Ls5、Ls3和Ls7在培養(yǎng)的第7天～第8天，半纖維素酶活力最高值均在3.11 U·mL-1以上。根據(jù)以上試驗結(jié)果推斷，在培養(yǎng)的第7天～第8天作為液體菌種使用時，菌株Ls5、Ls3和Ls7分解半纖維素類培養(yǎng)料的能力最強。

2.5 不同花臉香蘑菌株胞外漆酶活性測定

測定不同花臉香蘑菌株胞外漆酶活性，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，菌株Ls1、Ls5和Ls3的漆酶活性始終較低且無明顯變化。其余5個菌株的漆酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，8個菌株在培養(yǎng)的第6天達到最高值，隨后下降。其中菌株Ls4漆酶酶活力最高為7.79 U·mL-1，其次為菌株Ls2和菌株Ls6。因花臉香蘑屬于草腐菌，所以漆酶活力對于其對培養(yǎng)基質(zhì)的分解能力影響較小。

圖5 不同花臉香蘑菌株胞外漆酶活性測定Fig.5 Determination of laccase activity of different Lepista sordida strains

3 結(jié)論

在液體菌種的篩選過程中，通常需要根據(jù)菌種生物量以及菌種對培養(yǎng)料的分解利用能力等方面進行考察。通過跟蹤測定8個花臉香蘑菌株液體菌種培養(yǎng)過程中發(fā)酵液pH、菌絲生物量以及胞外羥甲基纖維素酶、半纖維素酶和漆酶活力，對供試菌株進行綜合考察和篩選。

由于花臉香蘑屬草腐性真菌，因此其對于培養(yǎng)料的利用主要以纖維素、半纖維素類成分為主，為篩選優(yōu)良液體菌種，菌絲生物量、羥甲基纖維素酶和半纖維素酶活力是主要考察因素。而漆酶作為具有分解木質(zhì)素類成分功能的酶，其活力高低對于花臉香蘑利用培養(yǎng)料的能力有一定的輔助作用[10]。綜合本研究的各項結(jié)果，菌株Ls3的液體菌種在培養(yǎng)的第7天～第8天，具有較高的菌絲生物量和羥甲基纖維素酶、半纖維素酶活性，是優(yōu)良的液體菌種工程菌株。當(dāng)培養(yǎng)料中含有一定木質(zhì)素類成分時菌株Ls7作為液體菌種進行使用也具有一定的優(yōu)勢。該結(jié)果為花臉香蘑人工栽培技術(shù)和優(yōu)良菌株選育等相關(guān)研究提供了一定的理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)，將有力促進這一珍稀食用菌品種的推廣應(yīng)用。