張 洪，楊昌彪，楊鴻波，龍昭航，李占彬*

（貴州省分析測(cè)試研究院，貴州 貴陽 550014）

玫瑰花茶（rose tea）是玫瑰花（Rosa rugosa）采摘后，經(jīng)適當(dāng)折瓣、攤放，去除花蒂、花蕊及其他雜質(zhì)，以凈花瓣和茶葉窨而制成[1]。玫瑰花含有氨基酸、黃酮類、多酚類及色素類等多種生物活性成分[2]，同時(shí)富含香茅醇、香葉醇及芐醇等多種揮發(fā)性香氣成分[3]，因此，玫瑰花茶具有通經(jīng)絡(luò)、活血補(bǔ)血、護(hù)膚美容、助消化、抗氧化等作用[4]，又因其香氣甜美，成為最受歡迎的花草茶之一。原花青素（procyanidins）是一類由不同數(shù)量的單體黃烷-3-醇縮合而成的聚多酚類物質(zhì)，單體含有典型的C6-C3-C6黃酮結(jié)構(gòu)，也屬于黃酮類化合物[5-6]，其代謝產(chǎn)物為兒茶素和表兒茶素，具有清除自由基的功能和較強(qiáng)的抗氧化作用[7]，是一類多酚天然抗氧化劑[8]，玫瑰花中含有豐富的原花青素。

目前，原花青素的檢測(cè)方法主要有薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）法及核磁共振法等[9-13]，雖然這些方法對(duì)原花青素的分離效果好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，但在生產(chǎn)中成本投入大，操作不方便。紫外分光光度法因其簡單易行、快速準(zhǔn)確，已應(yīng)用于藍(lán)莓[14]、藍(lán)靛果[15]等產(chǎn)品中原花青素含量的檢測(cè)，而應(yīng)用于玫瑰花茶尚未見報(bào)道。此外，均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)聯(lián)用的方法在產(chǎn)品加工工藝優(yōu)化試驗(yàn)中已有廣泛應(yīng)用[16-17]，但應(yīng)用于檢測(cè)方法的研究與開發(fā)的報(bào)道卻較少。

本研究擬采用紫外分光光度法檢測(cè)玫瑰花茶中的原花青素，以乙醇作為提取溶劑[18]，硫酸鐵銨催化比色[19-20]，選取影響玫瑰花茶中原花青素檢測(cè)的因素，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)初步優(yōu)化原花青素檢測(cè)條件，在此基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)方法，為玫瑰花茶中原花青素的分析檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花茶：貴州省貞豐縣；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇、丙酮：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；鹽酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正丁醇：成都市科隆化學(xué)品有限公司；十二水合硫酸鐵（Ⅲ）胺：上海沃凱生物科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1901PC型紫外可見分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；SK250HP型超聲波清洗機(jī)：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋：金壇市恒豐儀器制造有限公司；BSM220.4型電子天平：上海卓精電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素檢測(cè)波長的選擇

準(zhǔn)確稱取5.0 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存[21]。準(zhǔn)確移取1.0 mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，采用紫外可見分光光度計(jì)在波長200～800 nm范圍內(nèi)對(duì)其進(jìn)行掃描，確定原花青素的最大吸收波長。

1.3.2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確吸取0、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙醇-鹽酸-水溶液（50∶0.1∶49.9，V/V）定容，配制質(zhì)量濃度分別為0、0.025 mg/mL、0.050 mg/mL、0.100 mg/mL、0.150 mg/mL、0.200 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6支10 mL具塞試管，分別加入6 mL正丁醇-鹽酸溶液[22]，1 mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及0.2 mL 0.04 mol/L硫酸鐵胺溶液，搖勻，沸水浴10 min，冷卻平衡10 min，在最大吸收波長處，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值。以原花青素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 玫瑰花茶中原花青素含量的檢測(cè)

稱取0.2 g（精確至0.001 g）經(jīng)粉碎的玫瑰花茶樣品，置于50 mL具塞試管中，加入乙醇-鹽酸-水溶液30 mL，超聲提取，室溫冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用該乙醇-鹽酸-水溶液定容，過濾，制成試樣溶液。在10 mL具塞試管中加入6mL正丁醇-鹽酸溶液，加入1mL試樣溶液及0.2mL0.04mol/L硫酸鐵胺溶液，搖勻，沸水浴，冷卻平衡，在最大吸收波長處，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣溶液中原花青素的質(zhì)量濃度，從而計(jì)算出玫瑰花茶中原花青素的含量。

1.3.4 均勻試驗(yàn)初步優(yōu)化原花青素含量的檢測(cè)方法

以原花青素含量（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇乙醇-鹽酸-水溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、鹽酸體積分?jǐn)?shù)（X2）、超聲提取時(shí)間（X3）、沸水浴時(shí)間（X4）、平衡時(shí)間（X5）為考察因素，采用U9（95）均勻試驗(yàn)初步優(yōu)化原花青素含量的檢測(cè)方法。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化原花青素含量的檢測(cè)方法

在均勻試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以原花青素含量（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、鹽酸體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲提取時(shí)間（C）為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化原花青素含量的檢測(cè)方法。

1.3.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

根據(jù)最佳檢測(cè)條件，制備3份玫瑰花茶試樣溶液，分別加入15 mg/g、30 mg/g、45 mg/g原花青素進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，將加標(biāo)樣原花青素含量與未加標(biāo)樣原花青素含量進(jìn)行比較，計(jì)算回收率[23]，其計(jì)算公式如下：

式中：p為回收率，%；c1為未加標(biāo)樣提取液的原花青素含量，mg/g；c2為加標(biāo)樣提取液的原花青素含量，mg/g；c3為加標(biāo)量，mg/g。

1.3.7 玫瑰花茶樣品分析及精密度試驗(yàn)

采用最佳條件下檢測(cè)6個(gè)玫瑰花茶樣品中原花青素的含量，計(jì)算原花青素含量及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素檢測(cè)波長的選擇

紫外可見分光光度計(jì)在波長200～800 nm處對(duì)原花青素掃描的結(jié)果見圖1。由圖1可知，原花青素在波長550 nm處有最大吸光度值，因此，確定最佳測(cè)定波長為550 nm。

圖1 原花青素紫外吸收波長的掃描結(jié)果Fig.1 Scanning results of ultraviolet absorption wavelength of proanthocyanidins

2.2 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖2 原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of proanthocyanidins

原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。由圖2可知，原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.972 4x-0.002 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，表明原花青素在質(zhì)量濃度0～0.200 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，可以用于原花青素含量的測(cè)定。

2.3 均勻試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

U9（95）均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of uniform tests

表2 均勻試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of uniform tests results

對(duì)表1的結(jié)果進(jìn)行多元線性逐步回歸分析，得到乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、鹽酸體積分?jǐn)?shù)（X2）、超聲提取時(shí)間（X3）、沸水浴時(shí)間（X4）、平衡時(shí)間（X5）對(duì)原花青素含量的二次回歸模型：Y=15.02-0.056 22X1X2+0.003 279X1X3。

由表2可知，回歸模型的P值=8.516 3×10-7＜0.01，極顯著。由回歸方程可知，X1與X2、X3存在交互作用，X4、X5對(duì)Y的影響非常小，對(duì)回歸方程進(jìn)行規(guī)劃求解，得出玫瑰花茶中原花青素的檢測(cè)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）50%、鹽酸體積分?jǐn)?shù)（X2）0.1%、超聲時(shí)間（X3）90 min、沸水浴時(shí)間（X4）為10 min、平衡時(shí)間（X5）為10 min。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在均勻試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、鹽酸體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲提取時(shí)間（C）為考察因素，原花青素含量（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表3極差分析可知，各因素對(duì)玫瑰花茶中原花青素檢測(cè)的影響主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)（A）＞鹽酸體積分?jǐn)?shù)（B）＞超聲提取時(shí)間（C），最佳檢測(cè)條件為A2B2C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、鹽酸體積分?jǐn)?shù)0.10%、超聲提取時(shí)間110 min。由表4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素檢測(cè)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），鹽酸體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間影響不顯著（P＞0.05）。故玫瑰花茶中原花青素檢測(cè)的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，鹽酸體積分?jǐn)?shù)0.10%，超聲提取時(shí)間110 min，沸水浴時(shí)間10 min、平衡時(shí)間10 min。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal tests

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，在最佳檢測(cè)條件下，玫瑰花茶中原花青素的平均加標(biāo)回收率為102.1%，RSD為3.64%，說明方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確度良好。

表5 原花青素的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of standard recovery rate tests of proanthocyanidins

2.6 樣品分析及精密度試驗(yàn)結(jié)果

在最佳檢測(cè)條件下，6份相同玫瑰花茶的原花青素含量測(cè)定結(jié)果見表6。由表6可知，RSD為1.56%，表明該方法具有較高的精密度。經(jīng)檢測(cè)，玫瑰花茶中原花青素平均含量為28.06 mg/g。

表6 玫瑰花茶中原花青素含量的測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of proanthocyanidins content in rose tea

3 結(jié)論

運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)聯(lián)用法建立紫外分光光度法測(cè)定玫瑰花茶中原花青素含量的檢測(cè)方法，最佳檢測(cè)條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，鹽酸體積分?jǐn)?shù)0.10%，超聲提取時(shí)間110 min，沸水浴時(shí)間10 min，平衡時(shí)間10 min，該檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率（102.1%）和精密度試驗(yàn)結(jié)果（1.56%）良好，靈敏穩(wěn)定、操作簡便。在此最佳條件下，測(cè)定玫瑰花茶中原花青素平均含量為28.06 mg/g。