劉 洋

（長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033）

黑木耳（Auricularia auricula）別名云耳、樹(shù)耳，是一種藥食同源的食用菌。含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和多種維生素與無(wú)機(jī)鹽，其中蛋白質(zhì)的含量相當(dāng)于肉類，維生素B2含量超過(guò)米、面、蔬菜和肉類，鐵的含量比肉類高100倍，鈣的含量是肉類的30～70倍，還含有磷和硫等構(gòu)成人體細(xì)胞原生質(zhì)的主要成分，因此被譽(yù)為“素中之葷”[1]。此外黑木耳中所含有的多種礦物質(zhì)元素還能使體內(nèi)的各種結(jié)石產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，使結(jié)石剝脫、瓦解，不斷脫屑縮小，然后再經(jīng)管道排出[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為黑木耳有滋潤(rùn)強(qiáng)壯、清肺益氣、補(bǔ)血活血、鎮(zhèn)靜止痛等功效[3]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳中含有多糖[4]、多酚[5]、黃酮[6]、黑色素[7]及膳食纖維[8]等活性成分，具有抗氧化[9]、抗腫瘤[10]、抑菌[11]、降血糖[12]、護(hù)肝[13]及預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[14]及抗血小板聚集、防止血栓形成[15]等多種生物活性，被人們稱為“食品阿司匹林”。

米酒含有豐富的維生素、葡萄糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分，能促進(jìn)新陳代謝，具有補(bǔ)血養(yǎng)顏、舒筋活絡(luò)、強(qiáng)身健體和延年益壽的功效，是老幼均宜的營(yíng)養(yǎng)佳品。

隨著人們生活水平的提高，對(duì)保健食品的需求越來(lái)越多，本研究擬將長(zhǎng)白山優(yōu)質(zhì)資源黑木耳與糯米進(jìn)行綜合開(kāi)發(fā)，利用糯米發(fā)酵中糖化酶及蛋白酶將黑木耳中的各種高分子物質(zhì)體外酶解成人體易于吸收的寡糖、氨基酸等小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增強(qiáng)黑木耳的營(yíng)養(yǎng)活性和生物利用度[16]，提高傳統(tǒng)米酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及保健功效，為黑木耳的深精加工及功能性食品的開(kāi)發(fā)提供新的途徑，增強(qiáng)黑木耳在國(guó)內(nèi)及國(guó)際市場(chǎng)上的影響力，對(duì)于推介吉林省優(yōu)質(zhì)特色資源、規(guī)劃黑木耳種植等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生山木耳：吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)；糯米：市售；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LB50T手持糖度計(jì)：深圳市德優(yōu)平科技有限公司；SPM-808智能生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；HH-8 型恒溫水浴鍋：蘇州江東精密儀器有限公司；Alcomat Super酒精度測(cè)試儀：意大利蓋博分析儀器公司；FA系列電子分析天平：天津市精拓儀器科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑木耳米酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

黑木耳干粉制備：挑選優(yōu)質(zhì)干黑木耳于30～40 ℃水中浸泡50～60 min，加水量以淹沒(méi)黑木耳為宜，清洗干凈后將其撈出，加適量水后用組織搗碎機(jī)破碎，取出漿液用膠體磨進(jìn)行細(xì)磨，用150、200目的兩層紗布過(guò)濾、置于105 ℃烘箱干燥24 h，得黑木耳干粉。

浸米、蒸煮、淋米、拌曲：糯米洗凈加水浸泡，米和水的料液比為1.0∶2.0（g∶mL），浸泡達(dá)米粒無(wú)白心，手捏即碎為宜。用水沖去白漿放入鍋內(nèi)進(jìn)行蒸飯，蒸煮約45 min后待米粒疏松，透明發(fā)亮后取出，用約20 ℃的涼水淋至室溫，將米飯置于缸內(nèi)，加甜酒曲與黑木耳干粉后攪拌均勻，中央挖出一個(gè)倒喇叭狀的小孔，便于觀察產(chǎn)酒情況。

糖化發(fā)酵：26～34 ℃糖化發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)24～72 h結(jié)束發(fā)酵。

滅菌：將米酒用發(fā)酵罐密封加熱至75 ℃左右殺菌15～20 min，冷卻后即制黑木耳米酒。

1.3.2 單因素試驗(yàn)方法

每次試驗(yàn)投入300 g糯米，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，分別考察黑木耳添加量（2%、4%、6%、8%、12%）、甜酒曲接種量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（32 h、40 h、48 h、56 h、64 h）4個(gè)因素對(duì)米酒理化指標(biāo)及感官評(píng)分的影響。通過(guò)控制變量法進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別選取固定參數(shù)為黑木耳添加量8%，甜酒曲接種量1%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h。

1.3.3 黑木耳米酒釀造工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)黑木耳添加量（A）、甜酒曲接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）為考察因素，依據(jù)單因素試驗(yàn)確定的中心值確定其試驗(yàn)水平，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，得到最佳釀造工藝，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平如表1[17-18]。

表1 黑木耳米酒釀造工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for brewing technology optimization of Auricularia auricula rice wine

1.3.4 測(cè)定方法

感官評(píng)價(jià)方法：由食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)專業(yè)12名學(xué)生組成感官評(píng)價(jià)小組，其中6男6女，參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》對(duì)評(píng)價(jià)小組成員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，產(chǎn)出成品當(dāng)天即進(jìn)行獨(dú)立品評(píng)賦分，樣品隨機(jī)編號(hào)，計(jì)算平均值。具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2[19-20]。

表2 黑木耳米酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of Auricularia auricula rice wine

酒精度：參照GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》；還原糖：參照GB/T 5009.7—2016《食品中還原糖的測(cè)定》；總酸：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》；氨基酸：參照GB5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定；菌落總數(shù)：參照GB/T 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》；大腸菌群：參照GB/T 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 黑木耳添加量對(duì)米酒品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著黑木耳添加量的增加，黑木耳米酒感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，酒精度起初稍有升高，添加量＞6%時(shí)開(kāi)始下降。黑木耳添加量較少時(shí)，米酒中黑木耳味道極淡，色澤較淺，有澀味，隨著黑木耳添加量的增加，米酒色澤逐漸變深呈褐色，口感爽滑，有黑木耳清香味道，酒體協(xié)調(diào)性好；黑木耳添加量為6%時(shí)，黑木耳米酒的感官評(píng)分達(dá)到了（89.1±1.5）分；黑木耳添加量超過(guò)6%時(shí)，由于黑木耳添加比例過(guò)大，相當(dāng)于拌曲加水量減少，影響后續(xù)酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精，酒精度下降，米酒風(fēng)味下降，產(chǎn)品口感黏稠，有膩口感，酒體呈現(xiàn)微渾，協(xié)調(diào)性差。因此選擇黑木耳添加量為4%、6%、8%用于響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 黑木耳添加量對(duì)黑木耳米酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of Auricularia auricula addition on alcohol content and sensory evaluation of A.auricula rice wine

2.1.2 甜酒曲接種量對(duì)米酒品質(zhì)的影響

圖2 甜酒曲接種量對(duì)黑木耳米酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of sweet Jiuqu inoculum on alcohol content and sensory evaluation of Auricularia auricula rice wine

由圖2可知，接種量為0.4～1.0%時(shí)，隨著甜酒曲接種量的增加，酒精度隨之增加，當(dāng)接種量偏低時(shí)甜酒曲中根霉及酵母菌生長(zhǎng)及糖化作用較低，原料不能完全發(fā)酵，導(dǎo)致米酒中酒精度偏低，酒香不突出，口感偏淡無(wú)味，隨著甜酒曲接種量增加，發(fā)酵速度加快，酒精度持續(xù)增加；當(dāng)接種量為1.0%時(shí)，米酒香氣濃郁，口感爽滑細(xì)膩，味道協(xié)調(diào)柔和，此時(shí)感官評(píng)分最高為（90±1.4）分；而當(dāng)接種量超過(guò)1.0%時(shí)，由于甜酒曲中根霉菌及酵母菌大量繁殖導(dǎo)致發(fā)酵體系急劇升溫，酵母菌中大量有害菌繁殖，引起酸敗現(xiàn)象，影響米酒澄清度，酒體風(fēng)味變得酸澀、泛苦，感官評(píng)分隨之下降。因此，選擇甜酒曲接種量為0.8%、1.0%、1.2%用于響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)米酒品質(zhì)的影響

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)黑木耳米酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory evaluation of Auricularia auricula rice wine

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，米酒的酒精度呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度較低時(shí)，甜酒曲中根霉及酵母菌的生長(zhǎng)及糖化發(fā)酵作用較低，原料利用率低，酒體渾濁，米酒口感寡淡無(wú)味，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃，酒曲中的根霉達(dá)到最適宜發(fā)酵溫度，根霉利用其淀粉酶活性可以將糯米淀粉及黑木耳中的高分子營(yíng)養(yǎng)成分分解成單糖、低聚糖等，同時(shí)自身發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，形成黑木耳獨(dú)有的清香及米酒香氣，口感爽滑、柔和，黑木耳米酒的感官評(píng)分達(dá)到了（88±1.5）分；溫度高于30 ℃，容易滋生微生物，同時(shí)隨著發(fā)酵速度加快會(huì)產(chǎn)生一系列副產(chǎn)物導(dǎo)致酒體變渾濁，有異味產(chǎn)生，酒體不協(xié)調(diào)，黑木耳米酒的感官評(píng)分下降。因此選擇發(fā)酵溫度為28 ℃、30 ℃、32 ℃用于響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)米酒品質(zhì)的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑木耳米酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content and sensory evaluation of Auricularia auricula rice wine

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，黑木耳米酒感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，酒精度持續(xù)升高。發(fā)酵時(shí)間較短，則糖化不完全，發(fā)酵液中還原糖含量及酒精度均較低，風(fēng)味不顯著；隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液酒精中糖分不斷轉(zhuǎn)換成乙醇和香氣物質(zhì)，導(dǎo)致感官評(píng)分分?jǐn)?shù)偏高，黑木耳米酒的感官評(píng)分達(dá)到了（87±1.4）分；發(fā)酵時(shí)間超過(guò)48 h，酒精度明顯升高，同時(shí)產(chǎn)生大量乙酸，酒體中酸味較重，酒味大，米酒有強(qiáng)烈的苦澀味，口感差，黑木耳米酒的感官評(píng)分下降。因此選擇40 h、48 h、56 h用于響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)黑木耳添加量（A）、甜酒曲接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）4個(gè)因素分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 黑木耳米酒釀造工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for brewing technology optimization of Auricularia auricula rice wine

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface tests results

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Design Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到4個(gè)因素的多元回歸方程：

由表4數(shù)據(jù)可知，模型P＜0.000 1（極顯著），失擬項(xiàng)P=0.285 6＞0.05（不顯著），說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ陀休^好的擬合性，相關(guān)系數(shù)R2=0.966 7和調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.955 3也表明模型擬合程度較好。4.85%的變異系數(shù)（CV）說(shuō)明模型的重現(xiàn)性很好?？梢岳没貧w方程確定黑木耳米酒釀造工藝條件。

顯著性檢驗(yàn)表明，對(duì)黑木耳米酒感官評(píng)分影響次序?yàn)椋篊（發(fā)酵溫度）＞B（接種量）＞D（發(fā)酵時(shí)間）＞A（添加量），與表3的方差分析結(jié)果吻合。其中一次項(xiàng)B、C、D及交互項(xiàng)BD二次項(xiàng)A2、C2、D2對(duì)米酒感官評(píng)分的影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)A及交互項(xiàng)AB、AC、AD對(duì)米酒感官評(píng)分的影響顯著（0.01＜P＜0.05）；其他因素對(duì)感官評(píng)分的影響不顯著（P＞0.05）。

圖5 黑木耳添加量、酒曲接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)黑木耳米酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between Auricularia auricula addition,sweet Jiuqu inoculum,fermentation temperature and time on the sensory evaluation of A.auricula rice wine

由圖5可以直觀看出各因素的交互作用對(duì)米酒感官品質(zhì)的影響，若曲線越陡峭則該因素對(duì)米酒感官評(píng)分的影響越大。由圖5可以看出發(fā)酵溫度（C）對(duì)米酒感官品質(zhì)影響最大，甜酒曲接種量（B）次之，與表4的方差分析結(jié)果相吻合。

2.3 優(yōu)化條件的確定和模型驗(yàn)證

通過(guò)軟件分析確定黑木耳米酒最佳釀造工藝為黑木耳添加量6.18%、甜酒曲接種量0.97%、發(fā)酵溫度29.50 ℃、發(fā)酵時(shí)間47.54 h，黑木耳米酒感官評(píng)分由公式計(jì)算出理論值為91.43分。為方便實(shí)際操作，調(diào)整黑木耳添加量6.2%、甜酒曲接種量為1.0%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間47.5 h，得到黑木耳米酒的感官評(píng)分為91.6分，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.19%，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，表明該試驗(yàn)結(jié)果具有一定的參考價(jià)值。

2.4 理化及微生物指標(biāo)分析

在黑木耳米酒最佳釀造工藝條件下測(cè)定酒精度為9.75%vol；總酸（以乳酸計(jì)）為0.78 g/100 g，這兩項(xiàng)理化指標(biāo)均符合中華人民共和國(guó)NY/T1885—2010質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。黑木耳米酒中微生物菌落總數(shù)29 CFU/g；大腸菌群1.58 MPN/g，未檢出其他致病菌，檢測(cè)結(jié)果符合中國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》對(duì)米酒中微生物的限量要求。針對(duì)糯米發(fā)酵制備米酒與黑木耳與糯米混合發(fā)酵制備米酒進(jìn)行游離氨基酸與還原糖含量對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明，混合發(fā)酵黑木耳米酒中氨基酸及還原糖含量分別為4.54 g/100 g以及10.73 g/100 g增加率分別為63.95%和60.96%，經(jīng)分析可知，黑木耳在發(fā)酵過(guò)程中利用甜酒曲中的蛋白酶和糖化酶在體外將黑木耳中大分子蛋白及多糖分解成易吸收小分子的氨基酸和寡糖等成分，可促使黑木耳的保健功效在人體內(nèi)發(fā)揮得更好。

3 結(jié)論

根據(jù)所建立的響應(yīng)面模型，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳釀造工藝條件為：黑木耳添加量6.2%、甜酒曲接種量為1.0%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間47.5 h，采用此工藝釀造的黑木耳米酒的感官評(píng)分為91.6分，其中還原糖及氨基酸理化指標(biāo)較單獨(dú)發(fā)酵米酒增加率超過(guò)60%，衛(wèi)生指標(biāo)符合國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)。黑木耳米酒湯色呈現(xiàn)褐色，有黑木耳清香及米酒香氣，味道協(xié)調(diào)柔和，酒體豐滿協(xié)調(diào)，有黑木耳米酒獨(dú)特的風(fēng)格，產(chǎn)品兼具營(yíng)養(yǎng)保健功效，不僅豐富了黑木耳發(fā)酵食品系列，提高黑木耳的利用率，還為開(kāi)發(fā)新型發(fā)酵酒飲品提供研究方向。