常艷旭，王濤，李晉，何俊，金華，馬琳，楊雪晶，3*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)/天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076

桑椹為?？浦参锷orusalbaL.的干燥果穗?，F(xiàn)代研究表明，桑椹具有抗氧化、延緩衰老、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、降血脂、降血糖等藥理作用[1]。生物堿、黃酮類和有機(jī)酸為桑椹的主要化學(xué)成分，如蘆丁有祛脂的效果、具有抗氧化能力[2]，綠原酸具有抑菌、抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等功效[3-4]。

2015版《中華人民共和國(guó)藥典》尚未規(guī)定桑椹的含量測(cè)定項(xiàng)中指標(biāo)成分，僅對(duì)其浸出物、水分、總灰分進(jìn)行檢查[5]。本研究選擇了桑椹飲片中7種成分(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷和槲皮素)為指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜法(HPLC)，建立桑椹飲片中7種成分同時(shí)測(cè)定方法，并對(duì)國(guó)內(nèi)不同地區(qū)、不同批次的桑椹飲片進(jìn)行測(cè)定，擬為桑椹飲片質(zhì)量控制指標(biāo)選擇和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，為桑椹藥用價(jià)值進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供質(zhì)量評(píng)價(jià)手段。

1 材料與方法

1.1 儀器

粉碎機(jī)(吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠)；離心機(jī)(Sigma)；天平(德國(guó)Sartorius公司，BP121S)；Mill-QⅡ型超純水器(Millipore公司)；XW-80A渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠)；SHB-111循環(huán)水式多用真空泵(西安太康生物科技有限公司)；Agilent 1260型高效液相色譜儀；SB-1000YDTD超聲清洗槽(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

紫云英苷對(duì)照品(批號(hào)：MUST-13092001)、綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：MUST-14091701)、隱綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：MUST-13013002)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：MUST-11040302)、槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：MUST-13072505)、異槲皮苷對(duì)照品(批號(hào)：A0439)和新綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：12031401)均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，其純度均>98%。

桑椹飲片購(gòu)自國(guó)內(nèi)不同省市的藥店，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥果穗，樣品保存于天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院。桑椹樣品粉碎，過(guò)60目篩，備用。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 江蘇漢邦科技有限公司ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以水(含0.2%甲酸)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序?yàn)?～36 min，7.6%～7.6%B；40～45 min，12%～13%B；55～70 min，17%～28%B；72～74 min，31%～32%B；76～96 min，38.2%～7.6%B；平衡時(shí)間為5 min；柱溫為35 ℃；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量為15 μL；吸收波長(zhǎng)360 nm。

1.3.2 樣品的制備 精密稱取桑椹粉末0.5 g，置于10 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇10 mL，稱質(zhì)量，超聲提取40 min，靜置放冷，補(bǔ)足質(zhì)量，14 000 r·min-1離心10 min后，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即為樣品溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 將對(duì)照品儲(chǔ)備液配制成含有新綠原酸(250 μg·mL-1)、綠原酸(1.4 mg·mL-1)、隱綠原酸(1 mg·mL-1)、蘆丁(800 μg·mL-1)、異槲皮苷(150 μg·mL-1)、紫云英苷(100 μg·mL-1)、槲皮素(100 μg·mL-1)的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取該混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成一系列濃度，記錄各濃度下的峰面積，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn) 精密度分為日間精密度和日內(nèi)精密度。日內(nèi)精密度為同一份樣品溶液在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，日間精密度為連續(xù)3 d內(nèi)每天連續(xù)進(jìn)樣6次。穩(wěn)定性試驗(yàn)為一份樣品溶液分別在0、2、4、6、8、12、24 h內(nèi)進(jìn)樣。重復(fù)性試驗(yàn)為平行制備6份桑椹樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣。

1.3.5 加樣回收率 精密稱定已知含量的桑椹藥材粉末0.250 g(平行操作6份)，分別按所含7種成分量的50%加入對(duì)照品，按照樣品處理方法進(jìn)行處理，測(cè)定加樣后7種成分的含量，計(jì)算加樣回收率。

2 結(jié)果

2.1 高效液相色譜法方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(μg·mL-1)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出回歸方程、相關(guān)系數(shù)(見(jiàn)表1)。分別以信噪比(S∶N)3∶1和10∶1作為檢測(cè)限(LOD)和最低定量限(LOQ)。從表1中可以得知，7個(gè)化合物在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.998 0，表明7個(gè)化合物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 7種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、LOD和LOQ

2.1.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn) 桑椹中各成分的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種成分日內(nèi)、日間精密度RSD<4.9%，表明該方法精密度良好；重復(fù)性RSD<2.4%，表明該方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性RSD<3.0%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

表2 7種成分精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率結(jié)果 %

2.1.3 加樣回收率 由表2結(jié)果可知，7種成分的平均回收率均在95.0%～105%，且RSD<4.4%，表明該方法對(duì)桑椹中7種成分的含量測(cè)定的準(zhǔn)確度較高。

2.2 桑椹飲片中7種化學(xué)成分含量

桑椹飲片樣品中7種成分以及對(duì)照品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。由表3可知，桑葚飲片中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)：新綠原酸10.96～478.82 μg·g-1；綠原酸5.82～2 619.6 μg·g-1；隱綠原酸9.56～1 657.58 μg·g-1；蘆丁26.8～1 307.58 μg·g-1；異槲皮苷7.78～253.48 μg·g-1；紫云英苷8.02～62.72 μg·g-1；槲皮素11.04～68.64 μg·g-1。

注：A.混合對(duì)照品溶液；B.桑椹飲片樣品溶液；1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；4.蘆??；5.異槲皮苷；6.紫云英苷；7.槲皮素。圖1 混合對(duì)照品和桑椹飲片的HPLC圖

表3 不同地區(qū)的桑椹飲片7種化合物含量測(cè)定結(jié)果(n=3) μg·g-1

注：—為對(duì)應(yīng)化合物的含量在檢測(cè)限下或該批次飲片中不含有該種成分。

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

在選擇流動(dòng)相過(guò)程中，因?yàn)樯ｉ┲谢衔锏臉O性范圍分布較廣，且化合物種類繁多，在色譜分離時(shí)不易得到理想的峰形，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，考察了0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈、0.1%磷酸水-乙腈、0.1%磷酸水-甲醇、0.1%磷酸水-甲醇乙腈(1∶1∶1)和0.2%甲酸水-乙腈等流動(dòng)相組成，發(fā)現(xiàn)水相為磷酸水的效果要優(yōu)于甲酸水，峰形較好，且分離度良好，同時(shí)整體的色譜分離檢測(cè)時(shí)間稍短。有機(jī)相乙腈的效果好于甲醇-乙腈(1∶1)、甲醇，其中加了甲酸的乙腈的色譜圖基線較不加甲酸的更加平穩(wěn)，但無(wú)明顯影響，因此選擇了0.2%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相。

3.2 提取條件的選擇

采用飲片粉碎后用超聲波提取，該方法具有簡(jiǎn)便、安全、有效等特點(diǎn)。在單因素提取條件下，以提取效果為指標(biāo)，提取時(shí)間結(jié)果為：40 min>20 min>30 min>10 min；溶劑濃度：60%>80%>100%>40%；料液比：1∶20>1∶15>1∶10>1∶5。運(yùn)用正交優(yōu)化試驗(yàn)法，選取甲醇濃度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素，每個(gè)因素為3水平，以桑椹中新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷和槲皮素7種成分的總含量為指標(biāo)，選用L9(34)正交設(shè)計(jì)，對(duì)桑椹中7種成分最佳超聲提取條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)甲醇濃度是最關(guān)鍵的影響因素，其次為料液比和提取時(shí)間；確定最佳提取條件為0.50 g桑椹粉末采用10 mL 80%甲醇溶液超聲提取40 min。

4 結(jié)論

本研究建立了一種穩(wěn)定、可靠的桑椹中7種黃酮類成分(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷和槲皮素)含量同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜(HPLC)方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，符合分析要求，并對(duì)不同地區(qū)、不同批次的桑椹飲片中7種成分的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，蘆丁為平均含量最高成分，而異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素平均含量較低，國(guó)內(nèi)不同地區(qū)所用桑椹飲片質(zhì)量存在較大差異，需要對(duì)其生產(chǎn)產(chǎn)地、加工方法、質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行深入研究，確保其臨床有效性。