利用AhMITE轉(zhuǎn)座子標(biāo)記鑒定花生F1代真?zhèn)坞s種

寧龍龍　劉佳佳　趙昆昆　李柯　李忠峰　馬興立　張幸果　殷冬梅

摘要：本試驗以花生品系花7616為父本、H1338為母本雜交得到的F1代群體為材料，利用AhMITE標(biāo)記對F1代真?zhèn)坞s種進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：F1代群體78個單株中有8株呈現(xiàn)母本單一條帶，50株呈現(xiàn)父本單一條帶，20株是雙親雜合帶型;結(jié)合父母本葉片表型特征，共有20個單株鑒定為真雜種，真雜種率為25.64%，與分子標(biāo)記鑒定結(jié)果一致。綜上，利用轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確地對雜交后代進(jìn)行鑒定，進(jìn)而為高世代RIL群體的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生;雜種鑒定;轉(zhuǎn)座子標(biāo)記

中圖分類號：S565.203.53文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）09-0063-05

Identification of Peanut F1 Authentic Hybrids by

AhMITE Transposon Markers

Ning Longlong， Liu Jiajia， Zhao Kunkun， Li Ke， Li Zhongfeng， Ma Xingli， Zhang Xingguo， Yin Dongmei

（College of Agronomy， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract This experiment used peanut line H1338 as female parent and Hua 7616 as male parent to identify the true and false F1 hybrids by AhMITE markers. The results showed that 8 of the 78 individual plants in F1 population showed a single band of female parent， fifty showed a single band of male parent， and 20 showed heterozygous bands of parents. Combined with the phenotypic characteristics of parents leaves， a total of 20 individual plants were identified as true hybrids， and the rate of true hybrids was 25.64%， which was consistent with the results of molecular marker identification. In conclusion， transposon molecular markers could accurately identify hybrid offspring， which laid foundations for the construction of high-generation RIL populations.

Keywords Peanut; Hybrid identification; Transposon marker

花生是重要的油料作物之一，不僅含油量高、營養(yǎng)價值豐富，還可以培肥土力、生物固氮。雜交育種是花生主要的育種方法，可通過基因重組綜合雙親優(yōu)良性狀，基因累加產(chǎn)生超親性狀，基因互作產(chǎn)生新性狀，使育種工作更具有目的性和創(chuàng)造性。

花生雜交F1代真假雜種鑒定常用傳統(tǒng)鑒定法和分子鑒定法。傳統(tǒng)鑒定法的優(yōu)點是簡便、直觀，但存在鑒定時間長、易受環(huán)境條件影響、可用形態(tài)標(biāo)記數(shù)量有限等缺點。隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，各種分子鑒定法不斷創(chuàng)新。分子標(biāo)記是傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記的發(fā)展，利用分子標(biāo)記技術(shù)可使許多以前無法進(jìn)行的研究得以實現(xiàn)。常見的分子標(biāo)記有4類，第1類為基于DNA雜交的分子標(biāo)記，主要有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）標(biāo)記、可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）標(biāo)記;第2類為基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的分子標(biāo)記，包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）標(biāo)記、簡單序列重復(fù)（SSR）標(biāo)記、序列特征性擴(kuò)增區(qū)域（SCAR）標(biāo)記、序列標(biāo)簽位點（STS）等;第3類為PCR與限制性酶切技術(shù)相結(jié)合的分子標(biāo)記，主要有擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS）;第4類為基于基因組測序技術(shù)開發(fā)的分子標(biāo)記，主要有單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入缺失標(biāo)記（In-Del）。目前，分子標(biāo)記應(yīng)用于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、基因定位、種質(zhì)資源的鑒定及分類和輔助選擇育種等多個方面。

轉(zhuǎn)座子標(biāo)記是一種以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記[1]。轉(zhuǎn)座子又稱為可移動因子，是指一段特定的DNA序列，可在染色體組內(nèi)移動，從一個位點切除插入到一個新的位點。微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件（miniature inverted repeat transposable elements）簡稱MITE元件，是近年來在植物、細(xì)菌和動物基因組中發(fā)現(xiàn)的一種非自主轉(zhuǎn)座的可轉(zhuǎn)座DNA元件。它的結(jié)構(gòu)組織和DNA轉(zhuǎn)座子具有相似的地方，兩端含有倒置重復(fù)序列（terminal inverted repeats，TIR），所處位點處具有正向重復(fù)（tandem short duplication，TSD）;不同之處在于位于TIR之間的DNA序列不編碼轉(zhuǎn)座所需的轉(zhuǎn)座酶，也不一定編碼功能性的基因產(chǎn)物。

AhMITE（微型倒轉(zhuǎn)重復(fù)轉(zhuǎn)座子）標(biāo)記即AhTE標(biāo)記，具有穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性高、操作簡單、耗時短等優(yōu)點。Patel等[2]報道花生MITE的插入導(dǎo)致ahFAD2B功能異常而產(chǎn)生高油酸花生突變體。王潔等[3]用MITE對花生不同雜交組合的F1代進(jìn)行鑒定。Gowda、俞朝、溫小杰等[4-6]認(rèn)為采用AhMITE標(biāo)記鑒定的花生擴(kuò)增產(chǎn)物片段差異大，利用瓊脂糖凝膠電泳就可區(qū)分真假雜種，很大程度上提高了育種效率。為了對雜交后代進(jìn)行真?zhèn)坞s種鑒定，從而為高世代RIL群體構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，本研究選擇葉片表型性狀與AhMITE分子標(biāo)記相結(jié)合的方法，對花生品系花7616（父本）、H1338（母本）的F1代雜種進(jìn)行真?zhèn)舞b定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用花生品系花7616（父本）、H1338（母本）雜交得到的F1群體為材料。親本均為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)花生課題組選育的純合自交系。

1.2 花生葉片DNA的提取

取新鮮葉片0.1 g 裝入2.0 mL的離心管中，置于液氮中速凍并充分研磨后加入800 μL的SLS提取液（pH=8.0），顛倒混勻20 min;加入等體積現(xiàn)配的酚+氯仿+異戊醇（25∶[KG-*2/3]24∶[KG-*2/3]1），顛倒混勻20 min;12 000 r/min離心10 min，吸取上清液至1.5 mL離心管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇混勻，-20℃靜置1 h;12 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，用75%乙醇漂洗2～3次，95%乙醇漂洗1次，晾干后加入適量ddH2O溶解，并對得到的DNA進(jìn)行相關(guān)質(zhì)量檢測。

1.3 花生親本AhMITE標(biāo)記的篩選

選取9對AhMITE引物（表1）對親本進(jìn)行多態(tài)性分析，選出能夠使雙親擴(kuò)增產(chǎn)物存在顯著差異且條帶清晰穩(wěn)定的引物進(jìn)行F1代雜種鑒定。

1.4 花生雜交F1代群體鑒定

利用篩選出的引物對F1群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時擴(kuò)增雙親，通過比較鑒別F1代真?zhèn)坞s種。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix為10 μL ，模板DNA為1 μL，上、下游引物各1 μL，加入ddH2O至總體積達(dá)20 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);72℃延伸7 min，待循環(huán)完成后4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1代群體DNA提取

經(jīng)分光光度計檢測可得，提取的DNA OD260/280均為1.8～2.0，OD260/230均為2.0左右，說明DNA提取質(zhì)量較好，可進(jìn)行后續(xù)試驗。對提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，待測樣品均能跑出明亮單一條帶。

2.2 AhMITE多態(tài)性標(biāo)記引物的篩選

由圖2可知，本試驗設(shè)計的9對引物均可擴(kuò)增出條帶。其中，引物AhTE0015、AhTE0016、AhTE0018各擴(kuò)增出2條帶型，不同親本中2條帶型均相同;引物AhTE0029、AhTE0078、AhTE0394、AhTE0389、AhTE0254、AhTE0191均在雙親中擴(kuò)增出1條帶型，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，僅有引物AhTE0389擴(kuò)增的雙親帶型存在顯著差異，母本帶型分子量為600 bp，父本帶型為300 bp。因此，本研究選用引物AhTE0389作為標(biāo)記專用引物。

2.3 F1代群體真假雜種鑒定

2.3.1 F1代群體表型鑒定 由圖3可以看出，不同親本的葉形存在差異：母本H1338的葉片較小，頂端向內(nèi)凹陷呈扇形，葉緣從基部到頂端基本呈直線;父本花7616葉片相對較大呈橢圓形，葉片從基部到頂端呈現(xiàn)一定弧度。因此，雜交F1代的表型應(yīng)介于兩者之間，即葉片既向內(nèi)凹陷，葉緣又有一定弧度。圖3中，F(xiàn)1-3葉型與母本完全一致，為假雜種， F1-4葉型與父本完全一致，為假雜種，F(xiàn)1-1、 F1-2、 F1-5、 F1-6表型介于父母本之間，鑒定為真雜種。根據(jù)葉片表型鑒定結(jié)果，F(xiàn)1代群體78個單株中有8株與母本葉型完全一致，50株與父本葉型完全一致，20株葉型介于兩者之間。

2.3.2 轉(zhuǎn)座子標(biāo)記鑒定 利用篩選出的引物AHTE0389對78個F1代進(jìn)行擴(kuò)增，若F1擴(kuò)增的條帶同時含有父母本的帶型則為真雜種，若只有母本的一條帶型則為假雜種。擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，編號為1、11、26、29、31、42、53、60的只有母本1條帶型，為假雜種，50個只具有父本的1條帶型，為假雜種;20個具有父母本的雜合帶型，為真雜種。

3 討論與結(jié)論

花生真?zhèn)坞s種的鑒定是構(gòu)建花生遺傳群體的中心一環(huán)，而花生遺傳群體的構(gòu)建則是選育新品種的基礎(chǔ)，因此鑒定花生真假雜種十分必要。形態(tài)標(biāo)記法是一種傳統(tǒng)的鑒定方法[7]，通過鑒定F1代表型可分辨真假雜種，但實際操作過程中往往受到多種因素的限制：用于鑒定的形態(tài)學(xué)標(biāo)記數(shù)量有限，而且有的標(biāo)記在一定生育期才能表現(xiàn)出來;標(biāo)記性狀受環(huán)境影響較大，有些標(biāo)記性狀與不良性狀發(fā)生連鎖，難以進(jìn)行鑒定;通過形態(tài)學(xué)標(biāo)記鑒定的雜種第2年要再次種植才能確定鑒定結(jié)果是否正確。因此，該方法存在效率較低并且費時的弊端。分子標(biāo)記直接在DNA水平上反映不同個體間差異[8]，可以在F1代直接鑒別真假雜種，用于鑒定的標(biāo)記幾乎遍布整個基因組，檢測座位近乎無限，并且自然界存在許多等位變異，無需人工創(chuàng)造突變[9]。此外，分子標(biāo)記鑒定的多態(tài)性高，不受環(huán)境條件影響，在植物的任何生育期尤其是早期即可進(jìn)行真假雜種鑒定[10]。

花生真假雜種鑒定通常采用簡單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）[1 12]，鑒定效果較好，但需要經(jīng)過垂直板聚丙酰胺凝膠電泳比較擴(kuò)增條帶的遷移距離，并且聚丙酰胺凝膠制膠和跑膠過程較為復(fù)雜。此外，利用特異SNP位點鑒定花生F1代真假雜種的結(jié)果準(zhǔn)確性較高，但對DNA質(zhì)量要求相對較高[13]。RAPD是一種常用的分子標(biāo)記方法，一次擴(kuò)增可產(chǎn)生許多條帶，但重復(fù)性及穩(wěn)定性較差。轉(zhuǎn)座子標(biāo)記是一種基于PCR的分子標(biāo)記，其在基因組中的插入或者缺失可引起不同個體間的差異。本試驗用SLS法提取花生DNA ，操作過程簡便、提取效率高、質(zhì)量好，可以同時進(jìn)行大批量DNA提取，同時，采用的轉(zhuǎn)座子標(biāo)記方法經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳就可以比較擴(kuò)增條帶的遷移距離，重復(fù)性及穩(wěn)定性好，操作步驟簡單容易掌握。此外，本試驗選擇的性狀在苗期就可表現(xiàn)出來，因此可提前進(jìn)行雜交后代的篩選，提高了篩選效率;采用表型性狀與分子標(biāo)記相互結(jié)合、互相驗證的方法，可以提高雜種鑒定的效率和構(gòu)建高世代RIL群體的準(zhǔn)確性。

目前，傳統(tǒng)育種技術(shù)與分子標(biāo)記的結(jié)合在花生的抗病育種、親緣關(guān)系的研究等方面做出巨大貢獻(xiàn)[14，15]。但由于遺傳基礎(chǔ)比較狹窄、分子標(biāo)記的多態(tài)性較低，花生分子標(biāo)記技術(shù)研究明顯滯后于其它作物[16]。就目前來看，應(yīng)用最多的是微衛(wèi)星分子標(biāo)記，但這類標(biāo)記的技術(shù)操作比較復(fù)雜[17]。轉(zhuǎn)座子標(biāo)記的出現(xiàn)為花生育種開辟了新途徑，相信隨著研究的深入和發(fā)展，轉(zhuǎn)座子將會在花生品種選育和性狀遺傳改良等方面發(fā)揮重要作用[18]。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]尹亮，任艷，石延茂，等.利用AhMITE1轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記鑒定栽培花生雜交F1代種子真?zhèn)蝃J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 47（12）：1-5.

[2]Patel M，Jung S，Moore K，et al. High-oleate peanut mutants result from a MITE insertion into the FAD2 gene[J].Theoretical and Applied Genetics， 2004， 108（8）：1492-1502.

[3]王潔，李雙鈴，王輝，等. 利用AhMITE1轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記鑒定花生F1代雜種[J].花生學(xué)報，2012， 41（2）：8-12.

[4]Gowda M V C，Bhat R S，Sujay V，et al. Characterization of AhMITE1 transposition and its association with the mutational and evolutionary origin of botanical types in peanut（Arachis spp.）[J].Plant Systematics and Evolution，201 291（3/4）：153-158.

[5]俞朝，馮英.植物MITEs研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2008，20（3）：213-218.

[6]溫小杰，張學(xué)勇，郝晨陽，等.MITE轉(zhuǎn)座元件在植物中的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（8）：2219-2226.

[7]任小平，姜慧芳，廖伯壽，等.花生分子標(biāo)記的研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報，2006，7（3）：368-371.

[8]蘇君偉，于樹濤，史普想，等.花生分子標(biāo)記的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，201 39（10）：5704-5705，5710.

[9]李雙鈴，王輝，任艷，等.利用熒光標(biāo)記SSR技術(shù)鑒定花生F1代雜交種[J].花生學(xué)報，2009，38（4）：35-38.

[10]盧圣棟主編.現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)[M].北京 ：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社， 1999：101-136.

[11]胡東青，王秀貞，唐月異，等.利用SSR標(biāo)記鑒定花生真雜種[J].花生學(xué)報，2012，41（4）：22-25.

[12]曹廣英，吳琪，王云云，等.利用SSR標(biāo)記鑒定花生雜交 F1代真假雜種[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48（1）：7-10， 15.

[13]韓燕，馬登超，劉譯陽，等.利用特異性SNP位點鑒定花生雜交F1代真假雜種[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，48（4）：14-17.

[14]趙婷，王俊宏，徐國忠，等.花生高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種與生物技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].熱帶作物學(xué)報，201 32（11）：2187-2195.

[15]董文召，湯豐收.我國花生優(yōu)質(zhì)育種的研究進(jìn)展及育種策略探討[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2002，18（2）：77-79.

[16]王傳堂，楊新道，于翔，等.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在花生品種鑒定上的應(yīng)用研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2006，21（S2）：110-113.

[17]李麗娜，付留洋，秦利，等.花生栽培種與野生種（Arachis stenosperma）種間雜種的創(chuàng)制、鑒定與遺傳分析[J].中國油料作物學(xué)報，2017，39（2）：137-144.

[18]王傳堂.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在花生上的應(yīng)用研究[J].中國油料作物學(xué)報，1999，21（4）：72-76.

收稿日期：2019-07-24

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（U1704232）;河南省花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（S2012-05-G03）

作者簡介：寧龍龍（1993—），男，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向為花生遺傳育種。E-mail： nllhnnd@outlook.com

通訊作者：殷冬梅（1972—），女，河南南陽人，博士，教授，主要從事花生遺傳育種研究。E-mail：yindm@126.com