花生DNA快速提取方法及應(yīng)用

李柯　趙昆昆　寧龍龍　馬倩　李忠峰　馬興立　張幸果　殷冬梅

摘要：為了能夠高效快速提取群體花生DNA，本研究在堿裂解法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步簡(jiǎn)化步驟，以不同濃度 NaOH溶液為提取液，采用直接吸取上清進(jìn)行PCR和吸取部分上清中和后進(jìn)行PCR，分析了兩種方法的提取效果。結(jié)果表明，用1.000 mol/L NaOH溶液裂解后，吸取部分上清中和后的DNA擴(kuò)增效果更好，與用SLS常規(guī)法提取的DNA質(zhì)量效果相同。該方法簡(jiǎn)便快捷，在很短的時(shí)間內(nèi)能夠提取大量花生群體材料的DNA，并具有較高的穩(wěn)定性，可在花生分子標(biāo)記輔助選擇育種中廣泛應(yīng)用，為不同基因型花生的高通量快速篩選奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生;DNA快速提取;堿裂解法

中圖分類號(hào)：S565.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）09-0068-05

A Rapid Extraction Method of Peanut DNA and Its Application

Li Ke， Zhao Kunkun， Ning Longlong， Ma Qian， Li Zhongfeng， Ma Xingli， Zhang Xingguo， Yin Dongmei

（College of Agronomy， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract In order to extract population peanut DNA efficiently and quickly， the steps were further simplified based on the alkaline lysis method. With different concentrations of NaOH solution as the extract， the extraction supernatant was used directly for PCR or partial supernatant was neutralized for PCR， and the extraction effects of the two methods were analyzed. The results showed that the DNA amplification effect was better after lysis with 1.000 mol/L NaOH solution and partial neutralization， which was the same as the DNA quality extracted by SLS conventional method. This method was simple and rapid， could extract the DNA of a large number of population materials in a short time， and had high stability， so it could be widely applied in molecular marker-assisted selection breeding of peanuts. It laid the foundation for high-throughput rapid screening of different genotypes.

Keywords Peanut; Rapid DNA extraction; Alkaline lysis method

花生是世界上主要油料作物之一，其出油率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于油菜、大豆、芝麻、向日葵等其他油料作物。在我國(guó)油料生產(chǎn)中，花生種植面積僅次于油菜，而單產(chǎn)和總產(chǎn)居第一位。隨著植物分子研究的進(jìn)一步發(fā)展，可通過(guò)分子標(biāo)記選擇育種、大規(guī)模雜交后代單株基因型鑒定等方式獲得高蛋白、高油酸、抗病抗逆、適產(chǎn)的花生品種[1]。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)能夠快速對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行篩選，而植物基因組DNA的提取是該方法的基礎(chǔ)[2]。一般實(shí)驗(yàn)室提取DNA 的方法有CTAB法[3]、SLS法、SDS法[4]、高鹽低pH法[5]，這些方法提取的DNA濃度高、完整性好，但缺點(diǎn)也非常明顯，操作步驟繁瑣復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，每次提取大致需要3～4 h。

PCR反應(yīng)靈敏，在反應(yīng)體系中有很少量的DNA存在就能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。分子標(biāo)記輔助選擇、雜種后代純度鑒定等工作中所需的DNA量很少，并且提取的 DNA 也不需要長(zhǎng)時(shí)間保存[6]。當(dāng)需要對(duì)大群體進(jìn)行基因組DNA的提取時(shí)，傳統(tǒng)提取方法工作量巨大，效率大大降低。另外，在提取過(guò)程中要用一些有毒試劑，會(huì)對(duì)研究者的身體造成危害[7]。因此，尋找一種簡(jiǎn)單、高效、低成本提取花生DNA 的方法很有必要。前人對(duì)DNA快速提取方法已經(jīng)進(jìn)行了許多研究。王蕾等[8]開發(fā)了一種改良TPS法提取花生DNA，不需液氮研磨，提取的DNA質(zhì)量較好，并且可用于SSR分析。劉宇等[9]在CTAB法的基礎(chǔ)上開發(fā)出一種DNA快速提取方法，并能夠用于高通量測(cè)序。這些方法雖有所改進(jìn)，但步驟還是比較繁瑣。Wang等[10]建立了一種利用NaOH快速提取植物基因組DNA的方法并成功應(yīng)用于PCR反應(yīng)。鄭琪等[11]利用堿裂解法對(duì)中藥炒制品的DNA進(jìn)行快速提取，并成功應(yīng)用于PCR反應(yīng)。徐宗昌等[12]利用堿法提取煙草基因組DNA并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因煙草檢測(cè)。孫莉萍等[13]利用堿裂解法提取番茄DNA并探討了不同稀釋濃度對(duì)后續(xù)PCR試驗(yàn)的影響。此外，該方法在大麥[14]、甘蔗[15]、甜菜[16]、水稻[17]、玉米[18]中都有研究。前人的研究證明堿裂解法提取的植物基因組DNA能夠成功應(yīng)用于PCR反應(yīng)，但該方法在花生中的應(yīng)用還未見報(bào)道。本研究對(duì)不同NaOH提取液濃度和是否需要在DNA提取液中加入緩沖液進(jìn)行了探討，建立了一種適用于花生的堿裂解快速DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料 [HT]供試材料為白沙1016、H2014、花814、鄭農(nóng)花7號(hào)、ZP08、7500、農(nóng)大花103等10份低油酸和10份高油酸花生材料。

1.1.2 主要試劑與儀器 [HT]固體NaOH購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH=8.8）以及瓊脂糖凝膠電泳所用的核酸染色劑（GoldViewⅠ型核酸染色劑）購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司;50×TAE緩沖液;BM 2000 DNA Marker購(gòu)于博邁德基因技術(shù)有限公司;Mix（2×Taq PCR StarMix with Loading Dye）購(gòu)自GenStar生物公司;PCR擴(kuò)增儀型號(hào)為2720 Thermal Cycler （Applied Biosystems）;多樣品組織研磨儀（JXFSTPRP-24）購(gòu)于上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;電泳儀型號(hào)為DYY-8C，購(gòu)自北京市61儀器廠;凝膠成像系統(tǒng)型號(hào)為Azure Biosystems C200。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制 0.1 mol/L Tris-HCl的配制：吸取適量的1.5 mol/L Tris-HCl，稀釋15倍即可獲得。

1 mol/L NaCl溶液的配制：稱取固體NaCl 584 g，用100 mL蒸餾水充分溶解。

NaOH溶液的配制：根據(jù)需要，稱取一定量的NaOH固體，配制成1.000 mol/L的NaOH溶液，稀釋成0.500、0.250、0.100、0.050、0.010 mol/L和0.005 mol/L的NaOH溶液。

0.5 mol/L EDTA·Na2溶液的配制：稱取744 g的EDTA·Na2，再以40 mL的蒸餾水進(jìn)行充分溶解，即可制得。

50×TAE緩沖液的配制：用滅菌去離子水將242 g 固體Tris和37.2 g固體EDTA·Na2充分溶解后，加入57.1 mL的冰醋酸，最后定容至1 L即可。

SLS提取液的配制：稱取SLS固體10 g倒入燒杯中，再加入100 mL的 1 mol/L Tris-HCl、100 mL的1 mol/L NaCl以及40 mL的0.5 mol/L EDTA·Na2，使其充分溶解后加入2‰的PVP，再轉(zhuǎn)至容量瓶中定容至1 L。然后高壓滅菌鍋中滅菌20 min后冷卻至室溫，再調(diào)節(jié)pH到8.0。

1.2.2 DNA提取 堿裂解法一：（1）分別剪取花生的根、莖、葉放置于2 mL的離心管中;（2）放入一個(gè)直徑為3 mm的鋼珠，再加入200 mL事先制備好的NaOH堿提取液;（3）將離心管在全自動(dòng)研磨儀中60 Hz研磨30 s;（4）直接吸取1 μL的上清液用于PCR反應(yīng)。

堿裂解法二：（1）（2）（3）步與堿裂解法一相同;（4）從研磨后的離心管中吸取10 μL上清于另一離心管中，取200 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液加入離心管中。（5）搖勻后吸取1 μL用于PCR反應(yīng)。

SLS法：（1）剪取適量花生的根、莖、葉放置于2 mL的離心管中。（2）加入200 μL事先配置好的SLS提取液，放入一個(gè)直徑為3 mm的鋼珠，經(jīng)研磨儀研磨后再加入400 μL SLS提取液和2%的巰基乙醇。（3）放入搖床搖晃30 min后再加入與SLS提取液等量的事先配置好的酚-氯仿-異戊醇（體積比為25∶[KG-*2/3]24∶[KG-*2/3]1）試劑。（4）放入搖床搖晃30 min，再以12 000 r/min離心10 min。（5）吸取上清液置于新的EP管中，加入等體積異戊醇（-20℃），上下緩慢翻轉(zhuǎn)（注意不要太過(guò)用力，以免破壞DNA的完整性），再放入-20℃冰箱冷凍至少30 min。（6）取出后以12 000 r/min離心10 min，而后將上清液倒出，DNA則殘留在離心管底部。（7）用75%的乙醇漂洗兩到三遍，最后放置于通風(fēng)處晾干后，加入100 μL的ddH2O溶解DNA。

1.2.3 PCR反應(yīng) （1） 引物設(shè)計(jì)：引物設(shè)計(jì)所用軟件為Primer Premier 5.0。由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物名稱和序列見表1。

（2）PCR反應(yīng)體系：采用30 μL反應(yīng)體系，其中DNA模板1 μL，正向引物和反向引物各1 μL，2×Mix 15 μL，ddH2O 12 μL。

（3）PCR反應(yīng)程序：本試驗(yàn)所用引物的PCR反應(yīng)程序設(shè)置見表2。

1.2.4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè) 以5 μL Marker（BM 2000 DNA Marker）作為標(biāo)記，然后吸取8 μL DNA溶液點(diǎn)入瓊脂糖凝膠的膠孔中，電泳25 min（U=120V），將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。

1.2.5 NaOH提取液濃度篩選?取花生材料白沙1016的根、莖、葉于2 mL的離心管中，分別加入不同濃度的NaOH溶液（濃度梯度為1.000、0.500、0.250、0.100、0.050、0.010、0.005 mol/L），采用堿裂解法一和堿裂解法二進(jìn)行DNA提取及PCR擴(kuò)增，對(duì)比擴(kuò)增結(jié)果從而篩選出不同方法不同組織合適的NaOH濃度。PCR反應(yīng)所用引物為Arahy.5913QL-F/Arahy.5913QL-R。

1.2.6 其他花生材料DNA的快速提取 利用上一步篩選出的合適濃度，對(duì)其他花生材料H2014、花 814、鄭農(nóng)花7號(hào)、ZP08、7500以及農(nóng)大花103的葉片進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。

1.2.7 堿裂解法與SLS法提取的DNA擴(kuò)增效果對(duì)比 對(duì)用合適的NaOH溶液和利用SLS法提取的白沙1016葉DNA各取1μL作為模板，用引物Arahy.5913QL-F/Arahy.5913QL-R;Arahy. 42CZAS-F/Arahy.42CZAS-R;Arahy.PYV8LV-F/Arahy.PYV8LV-R; Arahy.RQKH3A-F/Arahy.RQKH3A-R; Arahy.N2H9FB-F/Arahy.N2H9FB-R進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)比尋找差異。

1.2.8 堿裂解法檢測(cè)單堿基插入 利用堿裂解法提取20份不同油酸含量的花生材料DNA，利用實(shí)驗(yàn)室建立的快速檢測(cè)單堿基插入/缺失的方法，檢測(cè)FAD2-2B基因中442位A堿基的插入。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜NaOH濃度的篩選

2.1.1 堿裂解法一NaOH適宜濃度的篩選 如圖1所示，只有0.050 mol/L的NaOH溶液提取的花生根部DNA能夠擴(kuò)增出條帶。而提取莖部DNA時(shí)，除1.000 mol/L和0.500 mol/L的NaOH溶液外，其他濃度都可以擴(kuò)出較亮的條帶。0.010～0.250 mol/L的NaOH溶液提取葉部DNA時(shí)可擴(kuò)增出條帶，其他濃度無(wú)法擴(kuò)出條帶。由此可知，直接吸取上清的方法在提取根部DNA時(shí)不適用，更適用于花生葉部和莖部DNA的提取。綜合考慮，若提取葉部和莖部DNA，堿裂解法一0.250 mol/L的NaOH提取液為最適濃度。

2.1.2 堿裂解法二NaOH適宜濃度的篩選 如圖2所示，用0.005～1.000 mol/L的NaOH溶液提取花生根、莖、葉的DNA作為模板都可以擴(kuò)增出條帶，但不同組織間存在差異。對(duì)于根部與莖部DNA，隨著NaOH提取液濃度的降低，擴(kuò)增出的條帶亮度也隨之降低，且DNA擴(kuò)增的效果沒有葉部DNA擴(kuò)增效果好。鑒于擴(kuò)增效果以及后續(xù)試驗(yàn)對(duì)于DNA的要求，本試驗(yàn)將1.000 mol/L的NaOH作為堿裂解法二的最適濃度。

2.2 堿裂解法二提取其他花生材料DNA后的擴(kuò)增效果

對(duì)上述兩種方法提取的DNA擴(kuò)增后的結(jié)果圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)吸取適量上清液加入緩沖液中和后進(jìn)行PCR 反應(yīng)比較穩(wěn)定，擴(kuò)增的條帶更為理想。由于本試驗(yàn)的目的是為了在大群體篩選時(shí)快速提取DNA用于PCR檢測(cè)，所取樣品都為葉片，因此本研究將在之后的試驗(yàn)中利用堿裂解法二對(duì)葉片DNA進(jìn)行提取。如圖3所示，取用不同花生材料的葉片，采用堿裂解法二提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增均獲得了理想結(jié)果，說(shuō)明堿裂解法二具有廣泛的適用性。

2.3 堿裂解法二與SLS法提取的DNA擴(kuò)增效果對(duì)比

如圖4所示，堿裂解法二與SLS法提取的DNA分別用5種不同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能獲得清晰明亮的條帶。由此說(shuō)明堿裂解法二提取的DNA完全可以應(yīng)用于PCR擴(kuò)增，且擴(kuò)增效果與SLS法相同。

2.4 堿裂解法二在單堿基插入檢測(cè)中的應(yīng)用

利用前文建立的快速DNA提取方法，提取20份不同油酸含量的花生材料DNA，用引物對(duì)Arahy.5913QL-F/Arahy.5913QL-R進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量（圖5），全部都能擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明提取的DNA可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。用檢測(cè)FAD2-2B基因中442位A堿基插入的引物對(duì)Arahy.5913QL-179F/Arahy.5913QL-179R檢測(cè)20份花生材料（圖6）。前期測(cè)序檢測(cè)到高油酸材料中都有442位A堿基的插入，低油酸材料中都沒有442位A堿基的插入，說(shuō)明該引物對(duì)只能在高油酸材料中擴(kuò)增出條帶，本研究建立的快速檢測(cè)方法結(jié)果與之完全相符（圖6）。因此，本試驗(yàn)建立的花生DNA快速提取方法能夠滿足分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)基因組DNA的要求。

3 討論與結(jié)論

本研究的主要目的是尋找一種簡(jiǎn)單、高效、低成本提取花生DNA 的方法，并將其應(yīng)用到雜種后代篩選及分子標(biāo)記輔助選擇中[19]。本試驗(yàn)對(duì)堿裂解法進(jìn)一步改進(jìn)，使其更簡(jiǎn)潔易行，并在花生中有很好的適用性。堿裂解法一中，使用1.000 mol/L和0.500 mol/L的NaOH提取液均不能擴(kuò)增出條帶，可能是因?yàn)檫@兩個(gè)濃度的溶液堿性超過(guò)了PCR反應(yīng)中所加Mix的緩沖能力，使酶失活，不能進(jìn)行擴(kuò)增;堿裂解法二中，所有濃度的NaOH提取液在根、莖、葉中均能擴(kuò)增出條帶。堿裂解法一提取根部DNA時(shí)，只有0.050 mol/L NaOH提取液能夠提取出DNA，且條帶亮度較弱，而莖部和葉部DNA的提取對(duì)于NaOH提取液的濃度也有要求范圍，若提取花生不同組織的DNA，堿裂解法一就需配制不同濃度的NaOH提取液，操作步驟復(fù)雜，而且提取的DNA擴(kuò)增效果并不理想。因此堿裂解法二更符合試驗(yàn)要求，能夠穩(wěn)定可靠地提取DNA。從試驗(yàn)結(jié)果的可靠性以及試劑配制的方便性上，建議采用1.000 mol/L的NaOH溶液作為提取液。

本試驗(yàn)方法與傳統(tǒng)提取DNA的方法相比，不需要復(fù)雜多樣的有毒試劑，使用的儀器少，能夠有效避免試驗(yàn)過(guò)程的污染;同時(shí)提取時(shí)間只需要10～20 min，提高了花生大群體基因型篩選和分子標(biāo)記輔助選種的效率。雖然傳統(tǒng)的提取法提取的DNA質(zhì)量好，但是對(duì)于PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)，只要有少量DNA模板的存在，就可以成功擴(kuò)增，對(duì)于DNA的質(zhì)量要求并不高。

本試驗(yàn)建立了一個(gè)穩(wěn)定、快速、低成本的適用于簡(jiǎn)單PCR反應(yīng)的花生DNA提取方法，提取的花生基因組DNA能夠應(yīng)用于單堿基插入的檢測(cè)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雜交后代選擇和分子標(biāo)記輔助篩選提供了極大方便。

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收稿日期：2019-07-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1704232）;河南省產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（S2012-05-G03）

作者簡(jiǎn)介：李柯（1995—），男，河南南陽(yáng)人，碩士研究生。

通訊作者：殷冬梅（1972—），女，河南南陽(yáng)人，博士，教授，主要從事花生遺傳育種工作。E-mail：yindm@126.com