胃炎靈顆粒劑微生物限度檢查方法驗(yàn)證

馬海玲，張?jiān)伱?，沈花，錢(qián)偉

胃炎靈顆粒劑為醫(yī)院制劑，由白芍、香附、枳實(shí)、川楝子、柴胡、黨參、黃芪及白術(shù)等中藥組成，功能疏肝理氣、清肝泄熱、解痙止痛。臨床治療膽汁反流性胃炎療效顯著。本方多藥合用，疏肝郁，安中焦，使脾胃升清降濁氣化復(fù)常。

中藥制劑在生產(chǎn)中的各個(gè)環(huán)節(jié)極易被微生物污染，影響藥品的質(zhì)量及安全，因此藥品的微生物檢驗(yàn)和微生物限度控制是保障藥品安全性的一項(xiàng)重要舉措［1］。微生物計(jì)數(shù)法包含平皿法、薄膜過(guò)濾法以及最可能數(shù)法，平皿法是微生物計(jì)數(shù)方法中最常用且應(yīng)用較廣的一種試驗(yàn)方法。本研究于2018年8—12月參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1105（微生物計(jì)數(shù)法）和1106［2］（控制菌檢查法）建立胃炎靈顆粒劑的微生物限度檢查方法，并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，以保證胃炎靈顆粒劑的質(zhì)量，提高檢測(cè)效率。

1 儀器與材料

1.1 儀器Milliflex Plus全自動(dòng)微生物過(guò)濾系統(tǒng)（密理博公司）、BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、HH-B11-500BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、LMQ-C51L立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、Transferpette-S移液器（德國(guó)普蘭德公司）、HH-W21-600S電熱恒溫水浴箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、MJ-150-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱（上海索譜儀器有限公司）、AUX220電子天平（日本島津公司）。

1.2 菌種枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501-2a18］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104-2a16-1］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003-5a23-1］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102-3a28-1］、白色念珠菌［CMCC（B）98001-2a11］、黑曲霉［CMCC（B）98003-2a11］，以上菌種均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，均為第三代。

1.3 培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)20161223）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)20161222）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號(hào)20160204）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)20161219）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)20161107）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)20161123）、PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)20161108），上述培養(yǎng)基均購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（批號(hào)20170721），購(gòu)于北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司。

1.4 樣品胃炎靈顆粒劑（規(guī)格：10克/袋；批號(hào)170206、170814、180319），自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備（1）將枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)24 h。吸取1 mL枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，加9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，采用10倍系列稀釋?zhuān)咕鋽?shù)不大于100 CFU/mL。（2）將白色念珠菌接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)48 h。取1 mL白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物，加9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，采用10倍系列稀釋?zhuān)咕鋽?shù)不大于100 CFU/mL。（3）將黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)7 d，取斜面培養(yǎng)物，用5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗脫，制備成孢子混懸液［3］。吸取1 mL混懸液，加9 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，采用10倍系列稀釋?zhuān)规咦訑?shù)不大于100 CFU/mL。

2.2 供試品溶液的制備從同一批次的兩個(gè)不同包裝中共稱(chēng)取胃炎靈顆粒劑10 g，加入PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為1∶10的供試品溶液。

2.3 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.3.1 常規(guī)法

2.3.1.1 試驗(yàn)組 取5份9.9 mL 1∶10供試液，分別加入2.1項(xiàng)下的相應(yīng)稀釋級(jí)別的5種試驗(yàn)菌株菌懸液0.1 mL，混勻，使最終試驗(yàn)組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。分別吸取1 mL上述含菌供試液于平皿中，平行操作制備2塊平皿，加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，32℃倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)。

2.3.1.2 菌液對(duì)照組 取5份9.9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，分別加入2.1項(xiàng)下的相應(yīng)稀釋級(jí)別的5種試驗(yàn)菌株菌懸液0.1 mL，混勻，使最終菌液對(duì)照組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。其余操作同2.3.1.1試驗(yàn)組。

2.3.1.3 供試品對(duì)照組 取9.9 mL 1∶10供試液，加入PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，不加菌懸液，混勻。其余操作同2.3.1.1試驗(yàn)組。

2.3.1.4 回收率測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)組平均菌落數(shù)與供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)的差值與菌液對(duì)照組平均菌落數(shù)的比值即為各試驗(yàn)菌株的回收率［4-6］。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 常規(guī)法測(cè)定不同批號(hào)胃炎靈顆粒劑需氧菌總數(shù)回收率結(jié)果

由結(jié)果可知，銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均在0.50～2.00范圍內(nèi)?？莶菅挎邨U菌、金黃色葡萄球菌的回收率分別為0.23、0.16，均低于0.50，常規(guī)法不適宜用于需氧菌總數(shù)的測(cè)定，需更換檢測(cè)方法。

2.3.2 培養(yǎng)基稀釋法

2.3.2.1 試驗(yàn)組 取2份9.9 mL 1∶10供試液，分別加入相應(yīng)稀釋級(jí)別的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，混勻，使最終試驗(yàn)組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。吸取0.2 mL含菌供試液于平皿中，平行操作制備5塊平皿，加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，32℃倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d結(jié)束后測(cè)定5塊平皿菌落數(shù)之和。

2.3.2.2 菌液對(duì)照組 取2份9.9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，分別加入相應(yīng)稀釋級(jí)別的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，混勻，使最終菌液對(duì)照組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。其余操作同2.3.2.1試驗(yàn)組。

2.3.2.3 供試品對(duì)照組 取9.9 mL 1∶10供試液，加入PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，混勻，不加菌懸液。其余操作同2.3.2.1試驗(yàn)組。

2.3.2.4 回收率測(cè)定結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定不同批號(hào)胃炎靈顆粒劑枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收率結(jié)果

由結(jié)果可知，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率分別為0.32、0.17，均低于0.50，培養(yǎng)基稀釋法不適宜用于上述2種試驗(yàn)菌的檢測(cè)，需更換檢測(cè)方法。

2.3.3 薄膜過(guò)濾法

2.3.3.1 試驗(yàn)組 取10 mL 1∶10供試液，用100 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗3次，在最后1次沖洗液中分別加入相應(yīng)稀釋級(jí)的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，過(guò)濾，取出濾膜，使菌面朝上放置于預(yù)制的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于32℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d后計(jì)數(shù)。

2.3.3.2 菌液對(duì)照組 分別取枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，用100 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗菌懸液，過(guò)濾，取出濾膜。其余操作同2.3.3.1試驗(yàn)組。

2.3.3.3 供試品對(duì)照組 取10 mL 1∶10供試液，用100 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，不加菌懸液，沖洗3次，過(guò)濾，取出濾膜。其余操作同

2.3.3.1 試驗(yàn)組。

2.3.3.4 回收率測(cè)定結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 薄膜過(guò)濾法測(cè)定不同批號(hào)胃炎靈顆粒劑枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收率結(jié)果

由結(jié)果可知，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的回收率在0.50～2.00范圍內(nèi)，說(shuō)明薄膜過(guò)濾法可用于胃炎靈顆粒劑需氧菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。

2.4 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.4.1 試驗(yàn)組 取2份9.9 mL 1∶10供試液，分別加入相應(yīng)稀釋級(jí)別的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉孢子懸液0.1 mL，混勻，使最終試驗(yàn)組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。分別吸取1 mL上述含菌供試液于平皿中，平行操作制備2塊平皿，加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，25℃倒置培養(yǎng)5 d后計(jì)數(shù)。

2.4.2 菌液對(duì)照組 取2份9.9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，分別加入相應(yīng)稀釋級(jí)別的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉孢子懸液0.1 mL，混勻，使最終菌液對(duì)照組中菌落數(shù)不大于100 CFU/mL。其余操作同2.4.1試驗(yàn)組。

2.4.3 供試品對(duì)照組 取9.9 mL 1∶10供試液，加入PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，不加菌懸液，混勻。其余操作同2.4.1試驗(yàn)組。

2.4.4 霉菌和酵母菌總數(shù)回收率測(cè)定結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 常規(guī)法測(cè)定不同批號(hào)胃炎靈顆粒劑霉菌和酵母菌總數(shù)回收率結(jié)果

由結(jié)果可知，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均在0.50～2.00范圍內(nèi)，說(shuō)明常規(guī)法可用于胃炎靈顆粒劑霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)。

2.5 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.5.1 菌液制備 將大腸埃希菌接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸取1 mL大腸埃希菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，加9 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，采用10倍系列稀釋?zhuān)咕鋽?shù)不大于100 CFU/mL。

2.5.2 供試品溶液的制備 同2.2項(xiàng)。

2.5.3 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(yàn)

2.5.3.1 試驗(yàn)組 取9.9 mL 1∶10供試液，加入0.1 mL大腸埃希菌菌懸液，兩者混勻后接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，32℃倒置培養(yǎng)72 h［7］。觀察結(jié)果。

2.5.3.2 供試品對(duì)照組 取10 mL 1∶10供試液接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其余操作同2.5.3.1試驗(yàn)組。

2.5.3.3 陽(yáng)性對(duì)照組 取大腸埃希菌菌懸液0.1 mL，接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其余操作同2.5.3.1試驗(yàn)組。

2.5.3.4 陰性對(duì)照組 取10 mL PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中［8］，其余操作同2.5.3.1試驗(yàn)組。

2.5.4 結(jié)果判斷 見(jiàn)表5。

表5 控制菌檢查結(jié)果

由結(jié)果可知，試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組有菌落生長(zhǎng)，鑒定試驗(yàn)呈陽(yáng)性，可判定檢出大腸埃希菌；供試品對(duì)照組、陰性對(duì)照組無(wú)菌落生長(zhǎng)。說(shuō)明胃炎靈顆粒劑的控制菌檢查可采用常規(guī)法。

3 討論

胃炎靈顆粒劑為中藥復(fù)方制劑，通過(guò)多味藥的協(xié)同作用發(fā)揮藥效，成分復(fù)雜，其中某一成分的抑菌作用都有可能會(huì)影響微生物限度檢查方法的準(zhǔn)確性［9］。采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定5種試驗(yàn)菌的回收率時(shí)，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于0.50。大量研究表明白芍、黃連、梔子、蒲公英、土茯苓均對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用［10-15］。黃芪、黨參、甘草均對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑制作用［16-17］。處方中的大量抑菌成分抑制了供試液中菌落的生長(zhǎng)，以致測(cè)得回收率低于0.50。

采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的回收率分別為0.87、0.97，處于0.50～2.00范圍內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)要求，說(shuō)明處方中的大量抑菌成分已隨沖洗液沖洗濾過(guò)去除。在微生物檢查過(guò)程中確保被檢樣品的抑菌活性被消除，才能真實(shí)的反應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果。因此本試驗(yàn)最終選擇薄膜過(guò)濾法進(jìn)行胃炎靈顆粒劑的需氧菌總數(shù)測(cè)定是可行的。

黑曲霉在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌落蔓延迅速至黑色厚絨狀，難以計(jì)數(shù)。為避免黑曲霉菌落計(jì)數(shù)誤差，在瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d后開(kāi)始逐日計(jì)數(shù)，而非培養(yǎng)結(jié)束后才開(kāi)始計(jì)數(shù)。

本研究經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，建立了胃炎靈顆粒劑的微生物限度檢查方法，結(jié)合胃炎靈顆粒劑的生產(chǎn)工藝，參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1107，進(jìn)行胃炎靈顆粒劑的微生物限度檢查時(shí)，采用薄膜過(guò)濾法測(cè)定胃炎靈顆粒劑的需氧菌總數(shù)，要求每1克胃炎靈顆粒劑中需氧菌總數(shù)不得超過(guò)1 000 CFU；采用常規(guī)法測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)，要求每1克胃炎靈顆粒劑中霉菌和酵母菌總數(shù)不得超過(guò)100 CFU；采用常規(guī)法檢查控制菌，要求每1克胃炎靈顆粒劑中不得檢出大腸埃希菌。