張修建

摘要：為了探索和研究池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖過程中微生物種群對養(yǎng)殖水質(zhì)的影響，在廊坊循環(huán)水試驗(yàn)池塘主養(yǎng)草魚成魚和大鱗鲃成魚的 2個水槽中的微生物開展了微生物多樣性分析研究。在養(yǎng)殖箱體進(jìn)水口、集污區(qū)集污區(qū)底部沉積物、填料附著物分別采集10個樣品，分成4組，并進(jìn)行微生物樣品對比分析。通過檢驗(yàn)，初步掌握了微生物種群變化情況。分析表明，投放填料浮球?qū)λ|(zhì)改善有一定的貢獻(xiàn)，對消除有害物質(zhì)、降低水體污染，減少能耗，實(shí)現(xiàn)池塘高效低碳養(yǎng)殖具有積極貢獻(xiàn)。

關(guān)鍵詞：微生物;工程化循環(huán)水;浮球;菌群

近年來，隨著淡水養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，池塘單產(chǎn)不斷提高，排入水中的有機(jī)物含量高，氮磷總量相應(yīng)增加，造成水體富營養(yǎng)化，這樣的水排入環(huán)境中，容易造成污染，因此，尋求一個高效科學(xué)健康的治理養(yǎng)殖水污染的措施或更加可持續(xù)發(fā)展的養(yǎng)殖模式是亟待解決的問題[1]。為大力開展現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)集成和模式創(chuàng)新，廊坊市水產(chǎn)技術(shù)推廣站引進(jìn)池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖模式，在永清縣右奕營村5畝池塘中建設(shè)循環(huán)水養(yǎng)殖水槽，同時，針對池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖模式發(fā)展需要，開展了池塘微生物多樣性的相關(guān)研究，以池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)為核心，在養(yǎng)殖箱體集污區(qū)內(nèi)投放填料浮球，浮球內(nèi)充填料物為過濾海綿。通過對箱體內(nèi)不同區(qū)域水質(zhì)及填料浮球附著物定期生物檢測，并進(jìn)行微生物樣品對比分析，為消除水體環(huán)境污染，降低能耗，實(shí)現(xiàn)池塘高效低碳養(yǎng)殖提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1樣品采集

分別在7月15日、8月15日和9月15日在養(yǎng)殖池中進(jìn)行采樣，采樣分組情況如表1所示。

2樣品檢測

2.1DNA提取、PCR和高通量測序

水樣帶回實(shí)驗(yàn)室之后先在通風(fēng)櫥中進(jìn)行抽濾，將濾膜用滅菌的手術(shù)刀剪碎，利用DNA試劑盒提取總DNA。進(jìn)行PCR擴(kuò)增（C，T = Y;G，A，T = D;A，C，G = V;A，C，G，T =N）。采用MiSeq測序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測序。

2.2測序數(shù)據(jù)的篩查與處理

運(yùn)用QIIME軟件識別疑問序列。隨后，通過QIIME軟件調(diào)用USEARCH檢查并剔除嵌合體序列獲取高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

2.3OTU劃分與分類地位鑒定

通過QIIME軟件調(diào)用UCLUST序列比對工具，按97%的相似度進(jìn)行序列歸并和OTU劃分（見表2）。

2.4菌群多樣性及分類組成分析

Alpha 多樣性分析反映的是單個樣品中的物種多樣性。進(jìn)行菌群稀疏曲線分析、群落豐度指數(shù)分析（Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)）、菌群多樣性指數(shù)分析（香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、辛普森指數(shù)（Simpson）），綜合評價細(xì)菌Alpha多樣性（見表3）。

通過樣品測序序列計(jì)算各樣品中細(xì)菌的多樣性指數(shù)，由表3可知，進(jìn)水口細(xì)菌群落7月、8月Chao1指數(shù)和ACE豐富度指數(shù)穩(wěn)定，9月份水體Chao1指數(shù)和ACE豐富度指數(shù)最高，說明進(jìn)水口細(xì)菌群落受外塘水體環(huán)境變化影響較大，池塘里魚類排泄物及殘?bào)w的存在，使得中上層的有機(jī)和無機(jī)物比較豐富，滿足微生物所需營養(yǎng)，因此微生物群落比較豐富[2]。集污區(qū)細(xì)菌群落7月、9月Chao1指數(shù)和ACE豐富度指數(shù)均比進(jìn)水口指數(shù)高，說明水槽集污效果明顯。9月份集污區(qū)底部沉積物和生物填料附著物中Chao1指數(shù)分別為： 1 950.21、2 605.88， ACE豐富度指數(shù)分別為2 127.95、2 512.60，說明細(xì)菌群落豐富度最高。9月份生物填料附著物中香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)分別為8.12，0.980 967，說明生物填料附著物中水體菌群生物多樣性最高，生物填料具有過濾作用，能降低水體污染。

2.5養(yǎng)殖水體細(xì)菌菌群分類學(xué)組成分析

將每個注釋上的物種歸類于不同的分類水平，并將 OTU 在不同樣品中的序列數(shù)進(jìn)行整理分析（見表4），如A1門OTU中鑒定到門的有25個，A1屬OTU種鑒定到種的有66個，依次類推。

2.5.1基于門分類水平進(jìn)行分析通過序列比對和注釋，并通過利用QIIME軟件，將對三種水體中的微生物在門和屬水平上的分類及相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在7月15日、8月15日和9月15日這3個月份的進(jìn)水口樣品中A1、A6和A10 豐度值依次是：Actinobacteria（放線桿菌門）（0.38/0.35/0.33）、Proteobacteria（變形菌門）（0.29/016/0.24）、Cyanobacteria（藍(lán)藻門）（0.08/0.32/0.21）、Bacteroidetes（擬桿菌門）（0.09/0.07/004）、Planctomycetes（浮霉菌門）（0.08/0.07/0.03）.由3個月份進(jìn)水口相比較而言8月份的A6進(jìn)水中藍(lán)細(xì)菌門的豐度最高，因8月份是暑期高溫時間，藍(lán)細(xì)菌門成為優(yōu)勢菌群;變形菌門豐度最低。

在7月15日、8月15日和9月15日這3個月份的集污區(qū)樣品A2、A3和A7豐度值依次：Actinobacteria（0.03/0.36/0.38）、Cyanobacteria（0.09/0.37/0.19）、Proteobacteria（0.25/0.11/0.23）、Planctomycetes（0.15/0.06/0.05）、Bacteroidetes（0.08/0.04/0.06）、Verrucomicrobia疣微菌門（0.03/0.01/0.04），由此可知8月份出水口的藍(lán)細(xì)菌門豐度最高，變形菌門豐度最低。

在8月15日和9月15日集污區(qū)底部沉積物A4和A8樣品豐度值依次是：Proteobacteria（038/0.22）、Firmicutes厚壁菌門（0.06/0.19）、Chloroflexi綠彎菌門（0.18/0.02）、Actinobacteria（0.02/0.16），集污區(qū)底部沉積物9月份相比較于8月份變形菌門、綠彎菌門和擬桿菌門呈現(xiàn)降低趨勢，厚壁菌門和放線桿菌門呈現(xiàn)增長趨勢。

在8月15日和9月15日生物填料附著物A5和A9樣品豐度值依次是：Proteobacteria（052/0.22）、Bacteroidetes（0.18/0.15）、Actinobacteria（0.08/0.12）、Firmicutes（0.01/0.11）、SR1（Absconditabacteria）（0.002/0.10），生物填料附著物樣品與8月份樣品相比較在9月份時變形菌門呈現(xiàn)降低趨勢，厚壁菌門和Absconditabacteria呈現(xiàn)增長趨勢.同時也可以看出生物填料可以聚集有利優(yōu)勢菌群。

2.5.2基于屬水平分析在7月15日、8月15日和9月15日這3個月份的進(jìn)水口樣品中A1、A6和A10 豐度值依次是：hgcI-clade（0.13/019/0.17），CL500-29marine group（0.1/0.1/0.1）、Prochlorococcus原綠球藻（0.03/0.19/014）、CL500-3（0.07/0.07/0.02）、Mycobacterium分支桿菌屬（0.05/0.01/0.05）、

Prochlorothrix原綠發(fā)藻屬（0.003/0.06/003）、Acidibacter食酸菌屬（0.02/0.01、0.03），與7月份和9月份相比較8月份的hgcI-clade、原綠球藻和原綠球藻屬呈現(xiàn)增長趨勢，分枝桿菌屬呈現(xiàn)降低趨勢;CL500-3與7月份和8月份相比較在9月份時豐度最低。

在7月15日、8月15日和9月15日這3個月份的集污區(qū)樣品中A2、A3和A7豐度值依次是：hgcI-clade（0.1/0.19/0.07）、CL500-29 marine group（0.08/0.11/0.11）、Prochlorococcus（0.02/0.17/0.09）、CL500-3（0.14/0.05/002）、Mycobacterium（0.04/0.01/0.06）、Prochlorothrix（0.0005/0.04/0.03），與7月份和9月份相比較8月份時hgcI-clade、原綠發(fā)藻屬、CL500-29 marine group和原綠球藻屬呈現(xiàn)增長趨勢，和分枝桿菌屬呈現(xiàn)降低趨勢但是在9月份時豐度又有所增加，CL500-3在9月份的豐度最低。

在8月15日和9月15日集污區(qū)底部沉積物A4和A8樣品豐度值依次是：Tabrizicola（0.07/0.006）、Arcobacter弓形菌屬（0/0.06）、Prochlorococcus（0.01/0.05）、鯨桿菌屬（0.02/0.03）、Mycobacterium分枝桿菌屬（0.000 6/0.04）、Lysobacter泥桿菌屬（0.04/0.000 25）、Nitrospira硝化螺旋菌屬（0.04/0.000 035）、Flavobacterium尼龍菌屬（0.03/0.000 21）集污區(qū)底部沉積物9月份相比較于8月份Tabrizicola呈現(xiàn)降低趨勢在9月份時甚至低于了0.1%。弓形菌屬、原綠球藻、鯨桿菌屬、分枝桿菌屬、泥桿菌屬、硝化螺旋菌屬、尼龍菌屬呈現(xiàn)增加趨勢。

在8月15日和9月15日生物填料附著物A5和A9樣品豐度值依次是：Sediminibacterium沉積桿菌屬（0.01/0.000 04）、Tabrizicola（0.11/0.000 03）Acetobacteroides醋酸桿狀菌屬（0.000 5/0.11）、Mycobacterium（0.02/0.04）、Rhodobacter紅桿菌屬（0.05/0.000 36）生物填料附著物樣品與9月份樣品相比較在8月份時醋酸桿菌屬和分枝桿菌屬呈現(xiàn)增長趨勢，沉積桿菌屬和Tabrizicola迅速降低甚至低于0.1%。生物填料起到了大量富集有益微生物的作用。

2.6水體菌群差異性分析

通過上述各菌群分類水平分析已經(jīng)初步表明各種水體微生物群落結(jié)構(gòu)是不同的。為了進(jìn)一步分析樣品間菌群群落復(fù)雜度的差異，利用 QIIME（Version1.50）平臺下基于UniFrac距離對樣品差異性進(jìn)行分析，在3個月份的進(jìn)水口樣品A1、A6和A10 進(jìn)水口中菌群結(jié)構(gòu)受主成分PC1影響最大，占總影響因子的64.22%，主成分 PC2占總影響因子的35.7%，主成分PC1和PC2三種主成分對樣品中菌群結(jié)構(gòu)的影響程度達(dá)到總影響因子的99.92%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用Unweighted（不考慮OTU豐度）的計(jì)算方法進(jìn)行主成分分析知道灰水重復(fù)性最高。從UPGMA 聚類樹分析知A1和A6兩次的進(jìn)水口的菌群差異性較小，而A10與這兩次的水體中的菌群差異性較大;在三個月份的進(jìn)水口樣品A2、A3和A7 出水口中菌群結(jié)構(gòu)受主成分PC1影響最大，占總影響因子的5625%，主成分 PC2占總影響因子的43.75%，主成分PC1和PC2三種主成分對樣品中菌群結(jié)構(gòu)的影響程度達(dá)到總影響因子的100%.從UPGMA 聚類樹分析知A2和A3兩次的進(jìn)水口的菌群差異性較小，而A7與這兩次的水體中的菌群差異性較大。

2.7菌群代謝功能預(yù)測

氨基酸代謝的菌群數(shù)量多也就說明有更加多的微生物分解有機(jī)氮，碳水化合物代謝菌群數(shù)量大可以幫助水體分解糖類等物質(zhì)，避免造成水體富營養(yǎng)化，使得箱體內(nèi)保持一個較好的水環(huán)境，有利于養(yǎng)殖。

3檢測結(jié)果

進(jìn)水口和出水口采樣時間為7、8和9月，在3個月份中進(jìn)水口和出水口統(tǒng)計(jì)出的OTU數(shù)都是9月份最高，集污區(qū)底部沉積物和生物填料附著物采樣時間為8、9月，兩者都是在9月份OTU數(shù)量最高，說明微生物物種數(shù)呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)變化，與池塘水溫相關(guān)，同時也可能與養(yǎng)殖周期所處的階段有關(guān)，9月處于養(yǎng)殖后期，而7月和8月處于養(yǎng)殖中期。

從門水平分析，進(jìn)水口和出水口微生物優(yōu)勢類群均為Actinobacteria（放線桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Cyanobacteria（藍(lán)藻門）。生物填料附著物和集污區(qū)底部沉積物共同的微生物優(yōu)勢類群有Proteobacteria、Firmicutes厚壁菌門、Actinobacteria。說明水處理系統(tǒng)中生物填料的微生物種類組成與集污區(qū)底部沉積物相似，同時進(jìn)水區(qū)和出水區(qū)的微生物種類組成相似，說明經(jīng)水處理后并未改變水體中微生物的組成。

從生物填料附著物的微生物多樣性指數(shù)分析，9月份的Chao1指數(shù)和ACE微生物豐度指數(shù)明顯高于8月份，微生物數(shù)量明顯升高，同時9月份的香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、辛普森指數(shù)（Simpson）指數(shù)也高于8月份，說明微生物的多樣性增加。上述結(jié)果證明生物填料對養(yǎng)殖水體菌群起到了明顯的富集和增殖效果。

從所有的微生物樣品分析，菌群代謝功能集中于氨基酸代謝、糖類代謝和能量代謝，原因可能是水體中的糞便和殘餌富含較多的有機(jī)氮和糖類，水體中微生物上述的菌體代謝功能有助于清除水體環(huán)境污染特別是其中的有機(jī)污染物。

水體或沉積物中的優(yōu)勢菌群中未發(fā)現(xiàn)病原菌。

參考文獻(xiàn)：

[1]

李建柱，侯杰，張鵬飛，等.空心菜浮床對魚塘水質(zhì)和微生物多樣性的影響[J].中國環(huán)境科學(xué).2016，36（10）：3071-3080.

[2] 李曉，李冰，董玉峰，等.精養(yǎng)團(tuán)頭魴池塘沉積物微生物群落的結(jié)構(gòu)特征及組成多樣性分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014，38（2）：225.