藏藥三味寬筋藤湯散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

黃銳 扎西東智 彭戈

【摘 要】 目的：建立藏藥三味寬筋藤散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：通過顯微鑒別法、理化鑒別法、薄層色譜法定性鑒別藏藥三味寬筋藤湯散中的寬筋藤、訶子2味藥材。HPLC法測定藏藥中沒食子酸含量，色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（2∶ 98）;二元梯度洗脫;流速1.0 mL/min;紫外檢測波長273 nm;柱溫40℃。結(jié)果：顯微鑒別寬筋藤、訶子的顯微特征典型，重復(fù)性好;理化鑒別生物堿沉淀反應(yīng)試驗(yàn)現(xiàn)象明顯，薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性樣品均無干擾。沒食子酸在0.00426～0.426 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 3），平均加樣回收率為100.1%，RSD為2.4%。結(jié)論：本研究建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、簡便，可用于藏藥三味寬筋藤湯散的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 三味寬筋藤湯散;寬筋藤;訶子;理化鑒別法;薄層色譜法;HPLC

【中圖分類號】R29 ??【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ???【文章編號】1007-8517（2019）18-0033-04

Abstract：Objective To establish the quality standard for Tibetan medicine Sanwei Kuanjinteng Decoction Powder. Methods Micro-identity，TLC and physical chemistry identity was used to qualitatively identify the Tinospora Sinensis and Chebulae Fructus，respectively.HPLC was used to determine the contents of gallic acid. The determination was performed on Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），binary gradient elution and the temperature of 40℃. The mobile phase was a mixture methanol and 0.2% phosphoric acid in a tatio of 2∶ 98 at a flow rate of 1.0 mL/min，and UV detection at 273 nm. Results Microscopic identification of Tinospora sinensis and Chebulae Fructus is typical with good repeatability. Physicochemical identification of alkaloids recipitation reaction test phenomena are obvious，TLC spots are clear， negative samples are not interfered. Gallic acid in the range of 0.004 26～0.426 mg/mL showed good linear relationship，R2=0.999 3;the average recovery detected by recovery test（n=6） measured was 100.1% ，RSD=2.4%. Conclusion The quality standard method established in this study is specific，reproducible and simple，and can be used for the quality control of Sanwei Kuanjinteng Decoction Powder.

Keywords：Sanwei Kuanjinteng Decoction Powder;Tinospora Sinensis;Chebulae Fructus;Physicochemical Identification;TLC;HPLC

三味寬筋藤湯散，藏文音譯是“勒哲松湯”，原方載于《四部醫(yī)典》，由寬筋藤、渣馴膏、訶子肉三味藏藥組成[1]，劑型為湯散劑，具有祛風(fēng)除痹、消腫止痛、干黃水的作用。用于關(guān)節(jié)急慢性紅腫、脹痛、伸屈不利、四肢僵硬，痛風(fēng)、痹證。作為經(jīng)典藏藥處方，在阿壩州藏醫(yī)醫(yī)院臨床上主要應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等，效果佳，但通過查詢尚無其質(zhì)量控制的相關(guān)文獻(xiàn)報道。訶子為 《中國藥典》收載的傳統(tǒng)藥物品種，尤其在民族醫(yī)學(xué)藏藥和蒙藥中最為常用[2]，為本處方的主要藥味之一，其有效成分沒食子酸的含量較高。沒食子酸具有解痙、抗氧化、抗菌及強(qiáng)心等藥理作用[3]，與三味寬筋藤湯散的臨床藥效密切相關(guān)。本文初步建立藏藥三味寬筋藤湯散的質(zhì)控項(xiàng)目，采用顯微鑒別法、薄層色譜法、理化鑒別法定性鑒別藏藥三味寬筋藤湯散中的寬筋藤、訶子2味藥材，高效液相色譜法測定沒食子酸相對含量，這對建立藏藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有著重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）;BX35生物顯微鏡II （奧林巴斯醫(yī)療株式會社）;JPCT0328全數(shù)字超聲波發(fā)生器（武漢嘉鵬電子有限公司）;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;AUW120D電子天平（SHIMADZU）;JA203H型電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）;HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）。

1.2 材料 沒食子酸對照品（批號：110831-201605，中國食品藥品檢定研究院）;訶子對照藥材（批號：121015-201605，中國食品藥品檢定研究院）;寬筋藤、訶子肉、渣馴藥材，經(jīng)阿壩州藏醫(yī)醫(yī)院澤戈主任藏醫(yī)藥師鑒定為正品，均由阿壩州藏醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供;三味寬筋藤湯散（批號：20190211，阿壩州藏醫(yī)醫(yī)院配制）;甲醇為色譜純，水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 寬筋藤為莖類藥材，渣馴膏為巖石中富含腐殖質(zhì)的古生物化石在地質(zhì)作用下滲出后，與復(fù)齒鼯鼠或紅耳鼠兔糞粒的混合物[4]，訶子肉為果實(shí)類藥材，三者顯微特征差別較大，具有互不干擾的專屬性特征，并易于觀察。將三味寬筋藤湯散制片后（染色片、水合氯醛透化片、水裝片等），置于顯微鏡下觀察。

2.1.1 寬筋藤 將三味寬筋藤湯散制片后在顯微鏡下觀察，可見韌皮纖維成束，周圍薄壁細(xì)胞含方晶成晶鞘纖維，為寬筋藤的顯微特征[5]。

2.1.2 訶子肉 將三味寬筋藤湯散制片后在顯微鏡下觀察，可見多數(shù)石細(xì)胞，呈類方形、類多角型或不規(guī)則形，有的一端稍膨大，細(xì)胞壁上紋孔密集，為訶子的顯微特征[6]。

2.2 理化鑒別[7] 寬筋藤中主要成分為生物堿[8]，參考藥品標(biāo)準(zhǔn)，對其生物堿進(jìn)行理化鑒別。取寬筋藤藥材、三味寬筋藤湯散、三味寬筋藤湯散（缺寬筋藤）三種粉末各5 g，分別加入酸性乙醇30 mL，回流30min，濾過，取濾液15 mL，用5%氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，水浴上蒸干，加入6 mL5%硫酸溶液溶解，濾過，取濾液3 mL分置A、B、C三支小試管中，每支試管1 mL，依次加入碘化鉍鉀試液、碘化汞鉀試液、硅鎢酸試液1～2滴，結(jié)果見表1。

2.3 薄層鑒別

參考文獻(xiàn)[9]和2015 年版《中國藥典》四部通則0502 薄層色譜法[10]，精密稱取三味寬筋藤湯散2 g，訶子對照藥材0.5 g，三味寬筋藤湯散（缺訶子肉）2 g，分別加入5 mL乙醇溶液，超聲處理（功率250W，頻率40kHZ） 0.5 h，放冷，取上清液濾過，取續(xù)濾液，待用。吸取上述三種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6∶ 10∶ 1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。三味寬筋藤湯散與訶子對照藥材在色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的斑點(diǎn)，三味寬筋藤湯散（缺訶子肉）無干擾。如圖1所示。

2.4 HPLC法測定沒食子酸的含量

2.4.1 色譜條件[11-12] 色譜柱：Inertsil ODS-SP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫：40℃;流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（2∶ 98）;流速1.0 mL/min;檢測波長273 nm;進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按沒食子酸計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品10.65 mg，置25 mL棕色量瓶中，加入50 %甲醇溶解并定容，即得0.426 mg/mL溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取三味寬筋藤湯散（20190211）0.4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4.4 陰性樣品溶液 按處方（除訶子肉藥材外）與制法，制成陰性樣品溶液。其余處理同供試品溶液。

2.4.5 測定法 分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。如圖2所示。2.4.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下沒食子酸對照品溶液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，得到對照品溶液濃度分別為：0.004 26、0.021 3、0.042 6、0.106 5、0.213、0.426 mg/mL溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL測定峰面積，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行回歸，得回歸方程為y=29193x + 141618（R2=0.9993），在0.004 26～0.426 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下沒食子酸對照品溶液0.5 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，精密吸取10 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得其平均峰面積值為717643，RSD為1.88%。表明儀器精密度良好。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測得峰面積RSD為1.42%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號（20190211）樣品6份，按2.4.3方法制備，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果沒食子酸平均相對含量為5.37 mg/g，RSD為0.88%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.4.10 加樣回收率試驗(yàn) 取三味寬筋藤湯散（20190211）6份，每份約0.2 g，精密稱定，1、2號樣品加入含有量50%沒食子酸對照品，3、4 號樣品加入含有量 100%沒食子酸對照品，5、6 號樣品加入含有量 150%沒食子酸對照品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，各取10 μL進(jìn)樣檢測，結(jié)果見表2。

2.4.11 耐用性 取三味寬筋藤湯散（20190211），按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備，分別在色譜條件小的變動條件下：柱溫（40.0±5）℃，流速（1.0±0.2）mL/min，波長（273±2）nm，測定沒食子酸相對含量的RSD為1.62%，結(jié)果表明，此高效液相色譜條件測定沒食子酸對照品時，柱溫、流速、波長的變動小時耐用性強(qiáng)，滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，本方法準(zhǔn)確可靠。

3 討論

3.1 理化鑒別 寬筋藤藥材標(biāo)準(zhǔn)鑒別項(xiàng)下中有加新配重氮化試劑，顯紅色，由于三味寬筋藤湯散含渣馴膏，其在提取過程中溶液顯酒紅色，這個顏色反應(yīng)不明顯，故選擇碘化鉍鉀試液、碘化汞鉀試液、硅鎢酸試液作為三味寬筋藤湯散的理化鑒別的顯色試劑，沉淀明顯。

3.2 薄層鑒別 預(yù)實(shí)驗(yàn)按照《中國藥典》2015年版訶子項(xiàng)下對訶子藥材進(jìn)行定性分析，樣品處理方法過于復(fù)雜，且重復(fù)性較差;樣品處理方法直接選擇超聲處理（功率250W，頻率40kHZ） 0.5h，放冷，取上清液濾過，取續(xù)濾液，待用;展開劑調(diào)整為甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6∶ 10∶ 1），噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱顯色，日光下檢視，對照藥材主斑點(diǎn)顯色明顯，供試樣品相應(yīng)位置斑點(diǎn)分離較好且陰性供試品無干擾。

3.3 色譜條件的選擇 根據(jù)

參考文獻(xiàn)[11-12]，選擇流動相：乙腈-0. 05%甲酸水溶液和甲醇-0.2%磷酸溶液，結(jié)果表明甲醇-0.2%磷酸對三味寬筋藤中沒食子酸的分離效果較好。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定流動相為甲醇-0.2%磷酸（2∶ 98），既能確保柱效的穩(wěn)定性，又可達(dá)到較好的分離效果。

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（收稿日期：2019-07-03 編輯：劉斌）