淫羊藿苷對局灶節(jié)段性腎小球硬化模型大鼠潑尼松抵抗的影響

陳威辛 戴恩來 王新斌 薛國忠

摘要：目的 ?觀察淫羊藿苷對局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）模型大鼠潑尼松抵抗的影響，探討其可能的作用機制。方法 ?48只Wistar雄性大鼠隨機分為對照組（10只）和造模組（38只），大鼠尾靜脈注射阿霉素（6.0 mg/kg）制備FSGS模型，大鼠尿蛋白>100 mg/24 h并隨機選取2只造模大鼠的腎組織病理為FSGS提示造模成功，其余36只大鼠隨機分為模型組（10只）、潑尼松組（10只）、淫羊藿苷組（8只）、潑尼松聯(lián)合淫羊藿苷組（聯(lián)合組，8只），給予相應(yīng)藥物灌胃干預(yù)6周，稱重，檢測24 h尿蛋白（24 h-UTP）、尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、膽固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）、皮質(zhì)醇（COR）、尿17-羥皮質(zhì)醇（U17-OHCS）水平，HE和Masson染色觀察腎組織病理變化，Western blot和RT-PCR分別檢測Nephrin、Podocin蛋白和mRNA表達。結(jié)果 ?與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量降低，出現(xiàn)大量蛋白尿，腎功能損害嚴重，伴低蛋白血癥及高脂血癥，血COR、U17-OHCS含量明顯降低（P<0.01），病理顯示腎小球出現(xiàn)硬化灶并縮小，部分腎小管內(nèi)可見蛋白管型，Nephrin、Podocin蛋白和mRNA表達明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，潑尼松組和淫羊藿苷組大鼠上述異常無明顯改善，聯(lián)合組低體質(zhì)量、蛋白尿、腎功能及代謝異常明顯改善，病理損傷改善，血COR、U17-OHCS含量明顯升高（P<0.05，P<0.01），Nephrin、Podocin蛋白和mRNA相對表達量明顯升高（P<0.05）。結(jié)論 ?淫羊藿苷可改善FSGS模型大鼠對潑尼松的抵抗性，其機制可能與保護足細胞相關(guān)。

關(guān)鍵詞：局灶節(jié)段性腎小球硬化;潑尼松;淫羊藿苷;大鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）11-0046-06

Abstract： Objective To observe the effects of icariin on prednisone resistance in rat models with focal segmental glomerulosclerosis （FSGS）; To explore its possible mechanism of action. Methods Totally 48 Wistar male rats were randomly divided into control group （10） and modeling group （38）. FSGS models were prepared by injection of doxorubicin （6.0 mg/kg） into the tail vein of rats. Rat urine protein >100 mg/24 h and 2 randomly selected rats were taken for renal histopathology as FSGS for successful modeling. The remaining 36 rats were randomly divided into model group （10）， prednisone group （10）， icariin group （8）， and prednisone combined with icariin group （joint group， 8）. Relevant medicine was given for gavage for 6 weeks. The rats were weighted， and 24 h urinary protein （24 h-UTP）， urea nitrogen （BUN）， creatinine （SCr）， total protein （TP）， albumin （ALB）， cholesterol （CHOL）， triglyceride （TG）， cortisol （COR）， and 17-hydroxycortisol （U17-OHCS） were detected. The pathological changes of renal tissues were observed by HE staining and Masson staining. The expressions of Nephrin， Podocin protein and mRNA were detected by Western blot and RT-PCR， respectively. Results Compared with the control group， body mass of model groupdecreased; a large amount of proteinuria， severe renal function impairment， hypoproteinemia and hyperlipidemia occurred; COR and U17-OHCS decreased （P<0.01）; pathologically， glomerular sclerosis appeared and narrowed; protein tubular type was observed in some renal tubules; the expressions of Nephrin， Podocin protein and mRNA significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， prednisone group and icariin group had no significant improvement on the above abnormalities. The joint group significantly improved low body weight， proteinuria， renal function and metabolic abnormalities; pathological damage was alleviated; the contents of COR and U17-OHCS significantly increased （P<0.05， P<0.01）; the relative expression levels of Nephrin and Podocin protein and mRNA significantly increased （P<0.05）. Conclusion Icariin can improve the resistance of prednisone in FSGS rats， and its mechanism may be related to the protection of podocytes.

Keywords： focal segmental glomerulosclerosis; prednisone; icariin; rats

局灶節(jié)段性腎小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）是激素抵抗型腎病綜合征（steroid resistant nephrotic syndrome，SRNS）的主要病理類型[1-2]，足細胞損傷是FSGS的核心事件[3]，保護足細胞是治療FSGS的關(guān)鍵[4]。中藥具有保護足細胞的作用[5-7]。戴恩來[8]從中西醫(yī)結(jié)合角度認為，脾腎陽虛是SRNS的普遍證型，溫補脾腎不僅能改善患者的陽虛之證，同時能增加激素的敏感性。課題組前期臨床觀察驗證了此假說[9-10]。淫羊藿為溫陽補腎的常用藥物，《本草綱目》言其“能益精氣”，淫羊藿苷為淫羊藿的提取物，屬黃酮醇苷類化合物，分子結(jié)構(gòu)明確，具有免疫調(diào)節(jié)等作用[11]。本實驗通過Wistar大鼠尾靜脈注射阿霉素建立FSGS模型，觀察淫羊藿苷是否有改善此模型對潑尼松抵抗性的作用，并探討其可能的作用機制。

1 ?材料與方法

1.1 ?動物

Wistar雄性大鼠48只，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心提供，動物質(zhì)量合格證號62001000000425，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗室，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝食飲水。

1.2 ?藥物

淫羊藿苷，陜西博林生物技術(shù)有限公司，批號BL20180511011;阿霉素，Solarbio，批號111C024，25 mg/支;潑尼松片，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號140146，5 mg/片。

1.3 ?主要試劑與儀器

GAPDH Polyclonal Antibody，ImmunoWay，批號YM3215;Anti-Nephrin抗體（EPR20993），Abcam，批號ab216341;Anti-NPHS2抗體，Abcam，批號ab50339;Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），ImmunoWay，批號RS0002;Goat Anti-Mouse IgG（H+L），ImmunoWay，批號RS0003;ECL化學(xué)發(fā)光顯色液，Millpore，批號WBKL50100;Trizol試劑，批號D912840，上海翊圣生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒，批號H4901003，上海翊圣生物科技有限公司;熒光定量試劑盒，批號H3912030，上海翊圣生物科技有限公司。

1.4 ?分組和造模

大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組（10只）和造模組（38只），尾靜脈注射阿霉素（6.0 mg/kg）制作FSGS模型[12-13]，1周后檢測大鼠尿蛋白>100 mg/24 h提示模型復(fù)制成功[14]，為加以驗證，隨機選取2只造模大鼠取腎組織病理為FSGS。造模組其余36只大鼠隨機分為模型組（10只）、潑尼松組（10只）、淫羊藿苷組（8只）、潑尼松聯(lián)合淫羊藿苷組（聯(lián)合組，8只）。

1.5 ?干預(yù)

潑尼松組按6.3 mg/（kg·d）潑尼松配制溶液灌胃，淫羊藿苷組按50 mg/（kg·d）[15]淫羊藿苷配制溶液灌胃，聯(lián)合組按上述劑量潑尼松加淫羊藿苷配制溶液灌胃，對照組和模型組給予等體積飲用水灌胃。給藥體積均為1 mL/100 g，連續(xù)6周。麻醉狀態(tài)下體外心臟采血并取腎組織行相關(guān)檢測。

1.6 ?指標檢測

1.6.1 ?一般指標

藥物干預(yù)期間每2周測體質(zhì)量1次，并收集24 h尿液1次，記錄尿量，3000 r/min離心5 min，無菌管收集尿液上清液，全自動生化分析儀免疫比濁法檢測24 h尿蛋白（24 h-UTP），末次尿液測17-羥皮質(zhì)醇（U17-OHCS）。體外心臟采血后靜置1 h，3000 r/min離心10 min，收集上清液，全自動生化分析儀檢測尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、膽固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）、皮質(zhì)醇（COR）。

1.6.2 ?腎組織病理形態(tài)觀察

將大鼠左側(cè)腎臟切除，生理鹽水清洗，剝離腎包膜，將腎臟上、下極切成0.5 cm厚的組織，裝入5 mL EP管中，加入4%組織細胞固定液，常溫固定48 h。常規(guī)HE和Masson染色，鏡下觀察，并利用Image J軟件采集圖像。

1.6.3 ?Western blot檢測腎組織Nephrin、Podocin蛋白表達

摘取大鼠右腎，去掉腎臟包膜后沿冠狀面剖開，然后縱向切開，分裝于2 mL凍存管中，編碼標記，立即投入液氮罐中，然后置于-80 ℃冰箱保存。取腎組織，各組稱100 mg腎臟組織，剪成碎片，置于5 mL EP管中，每20 g組織加200 μL RIPA組織細胞裂解液，電動勻漿，取出裂解液，4 ℃、13 000 r/min離心5 min，取上清液，用紫外分光光度計測定蛋白濃度，BCA定量蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度至一致，每30 μL蛋白樣品加10 μL上樣緩沖液，震蕩混勻后置于金屬水浴鍋98 ℃加熱5 min，即得到蛋白裂解液。按照十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳的步驟操作，用封閉液稀釋GAPDH抗體（1∶5000）、Nephrin抗體（1∶1000）、Podocin抗體（1∶500），使用Image J軟件計算各條帶的密度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的比值，進行分析。

1.6.4 ?實時熒光定量PCR檢測Nephrin、Podocin mRNA表達

引物序列由寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司合成。Nephrin：上游5-GCCCAATACACACAGAACGTC-3，下游5-CATTCATACTCTGCGTCATCA-3，擴增產(chǎn)物長度203 bp;Podocin：上游5-CGACCAGAGGAAGGG ATCA-3，下游5-TGGCTTTGGACACATGAGCTA-3，擴增產(chǎn)物長度378 bp;β-actin：上游5-GTTGTCCCT GTATGCCTCTG-3，下游5-GGAGCCAGGGCAGTA ATCT-3，擴增產(chǎn)物長度548 bp。用Trizol提取腎組織中總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進行PCR擴增，用熒光定量試劑盒進行反應(yīng)，條件：95 ℃預(yù)熱7 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后制備融解曲線，以β-actin作為內(nèi)參，用2-??Ct法計算Nephrin、Podocin mRNA相對表達量。

1.7 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用完全隨機設(shè)計多樣本方差分析，進行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，符合正態(tài)要求用方差分析;方差齊時兩兩比較用LSD法或SNK法，數(shù)據(jù)不符合方差齊性采用Grames-Howell法進行兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?一般狀況

實驗大鼠造模后精神狀態(tài)日漸萎靡，飲食減少，大便稀。藥物干預(yù)后，對照組大鼠體質(zhì)量增加，精神狀態(tài)、體毛保持良好，對周圍環(huán)境敏感，模型組大鼠體毛發(fā)暗、反應(yīng)遲鈍、弓背蜷縮、大便稀溏，墊料濕且伴有明顯騷臭味，體形偏瘦;與模型組比較，潑尼松組和淫羊藿苷組改善不明顯，聯(lián)合組明顯改善，體毛較光滑，墊料較干，且體形較豐滿，警覺性較強。模型組大鼠體質(zhì)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），潑尼松組、淫羊藿苷組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），聯(lián)合組大鼠干預(yù)4、6周時體質(zhì)量高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表1。

2.2 ?潑尼松聯(lián)合淫羊藿苷對模型大鼠24 h尿蛋白的影響

對照組大鼠尿蛋白量無明顯變化，造模組大鼠24 h-UTP均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;干預(yù)2周時，潑尼松組大鼠24 h-UTP明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其余時間點潑尼松組、淫羊藿苷組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;聯(lián)合組大鼠24 h-UTP隨干預(yù)時間的增加逐漸降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表2。

2.3 ?潑尼松聯(lián)合淫羊藿苷對模型大鼠腎功能、血蛋白、血脂的影響

與對照組比較，模型組大鼠BUN、SCr、CHOL、TG均明顯升高，TP、ALB明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，潑尼松組大鼠BUN、SCr、CHOL、TG無明顯變化（P>0.05），TP、ALB明顯降低（P<0.05），淫羊藿苷組大鼠BUN、SCr、TP、ALB無明顯變化（P>0.05），CHOL、TG明顯降低（P<0.01），聯(lián)合組大鼠BUN、SCr、CHOL、TG明顯降低，TP、ALB明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見表3。

2.4 ?潑尼松聯(lián)合淫羊藿苷對模型大鼠腎陽虛指標血皮質(zhì)醇、尿17-羥皮質(zhì)醇含量的影響

模型組大鼠血COR、U17-OHCS含量明顯低于對照組（P<0.01）;與模型組比較，潑尼松組大鼠血COR、U17-OHCS含量明顯降低（P<0.01），淫羊藿苷組大鼠血COR含量明顯增加（P<0.01），U17-OHCS無明顯變化（P>0.05），聯(lián)合組大鼠血COR、U17-OHCS含量明顯增加（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表4。

2.5 ?病理變化

對照組大鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常;模型組、潑尼松組、淫羊藿苷組大鼠腎小球發(fā)生硬化縮小，腎小囊腔擴大，部分腎小管內(nèi)可見蛋白管型;聯(lián)合組大鼠病理損傷較模型組明顯改善，仍有系膜增生，結(jié)構(gòu)紊亂，腎小囊腔粘連等病理改變。結(jié)果見圖1、圖2。

2.6 ?潑尼松聯(lián)合淫羊藿苷對模型大鼠腎組織Nephrin、Podocin蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠腎組織Nephrin、Podocin蛋白表達明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，潑尼松組大鼠腎組織Nephrin、Podocin蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），淫羊藿苷組大鼠腎組織Nephrin蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），Podocin蛋白表達明顯降低（P<0.05），聯(lián)合組大鼠腎組織Nephrin、Podocin蛋白明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見圖3。

2.7 ?潑尼松聯(lián)合淫羊藿苷對模型大鼠腎組織Nephrin、Podocin mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠腎組織Nephrin、Podocin mRNA表達明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，潑尼松組、淫羊藿苷組大鼠腎組織Nephrin、Podocin mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），聯(lián)合組大鼠腎組織Nephrin、Podocin mRNA表達明顯升高（P<0.05）。結(jié)果見表5。

3 ?討論

臨床上FSGS多對糖皮質(zhì)激素抵抗，成為SRNS的常見病理類型。本實驗中，潑尼松組給予潑尼松6周后大鼠24 h-UTP、BUN、SCr及病理結(jié)果與模型組無顯著差異，表明實驗大鼠FSGS同樣對潑尼松抵抗，與臨床現(xiàn)象一致。

FSGS出現(xiàn)激素抵抗后治療頗受關(guān)注。戴恩來[8]根據(jù)臨床實際經(jīng)驗結(jié)合中醫(yī)理論認為溫陽法能改善糖皮質(zhì)激素抵抗，提高療效。本研究選用溫陽補腎中藥淫羊藿的主要成分淫羊藿苷聯(lián)合潑尼松治療，發(fā)現(xiàn)模型大鼠24 h-UTP、BUN、SCr及病理結(jié)果明顯改善，表明淫羊藿苷可減輕FSGS大鼠對潑尼松抵抗，改善大鼠腎功能。

激素抵抗原因眾多，包括基因突變[16]、糖皮質(zhì)激素受體水平降低或亞型比例失調(diào)[17]、糖皮質(zhì)激素轉(zhuǎn)運的伴侶分子HSP90表達異常[18]及足細胞損傷等[19]，有研究發(fā)現(xiàn)，足細胞損傷越重，激素抵抗性越重[20]。Nephrin、Podocin是腎小球濾過膜上裂孔隔膜的重要組成蛋白，連接相鄰足細胞的足突，由足細胞產(chǎn)生，是足細胞損傷的標志蛋白。本實驗?zāi)Ｐ徒M大鼠腎組織Nephrin、Podocin及mRNA相對表達量明顯降低，說明阿霉素致FSGS形成是足細胞損傷的過程，潑尼松組、淫羊藿苷組無明顯療效，Nephrin、Podocin蛋白和mRNA表達亦無明顯上調(diào)，而聯(lián)合組24 h-UTP、BUN、SCr及病理結(jié)果明顯改善的同時，Nephrin、Podocin及mRNA相對表達量也明顯上調(diào)，表明聯(lián)合組療效與保護足細胞有關(guān)。

證的本質(zhì)研究有助于闡明中醫(yī)治病的具體機制。沈自尹等[21]認為，體內(nèi)下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸是腎陽的物質(zhì)基礎(chǔ)，COR是腎上腺分泌的內(nèi)源性皮質(zhì)醇，U17-OHCS是其代謝產(chǎn)物，是腎陽虛的常見指標[22]，降低意味著HPA軸功能減退，腎陽不足。本實驗中模型組血COR、U17-OHCS含量降低，與文獻中阿霉素所致腎病為腎陽虛證的結(jié)論[23-24]相一致，潑尼松組經(jīng)潑尼松干預(yù)后血COR、U17-OHCS含量更低，其原因是潑尼松反饋性抑制HPA軸，國內(nèi)應(yīng)用此原理以潑尼松制作腎陽虛模型驗證了這一觀點。腎陽虛是中醫(yī)對機體一種功能狀態(tài)的概括，主要包括畏寒肢冷、完谷不化、性欲減低、神情淡漠等，在各種亞健康、慢性病中常見，藥證相對，應(yīng)用溫補腎陽藥物有改善作用，隨著證的轉(zhuǎn)機有助于病的好轉(zhuǎn)，淫羊藿苷組單純應(yīng)用淫羊藿苷，血COR上調(diào)，進一步表明淫羊藿苷溫腎陽的作用，但淫羊藿苷組腎功能未見好轉(zhuǎn)，說明淫羊藿苷未能控制病情，聯(lián)合組潑尼松和淫羊藿苷聯(lián)合應(yīng)用，腎陽虛好轉(zhuǎn)，病情緩解，起到減毒增效作用。中藥在整體層面調(diào)節(jié)機體內(nèi)環(huán)境，為西藥精準治療創(chuàng)造了有利環(huán)境，聯(lián)合應(yīng)用，證與病同治，相得益彰。

本實驗結(jié)果表明，溫陽法可改善模型大鼠對潑尼松的抵抗性，其機制可能與保護足細胞相關(guān)。糖皮質(zhì)激素抵抗的機制復(fù)雜，改善其抵抗性的原理有必要進一步研究，對潑尼松聯(lián)合淫羊藿苷的量效關(guān)系有必要進一步探索。本實驗中藥物干預(yù)6周，臨床上對人的激素抵抗以12周無療效為標準，今后研究需探討是否進一步延長FSGS大鼠的干預(yù)時間。

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（收稿日期：2019-04-19）

（修回日期：2019-05-21;編輯：華強）